【摘 要】
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嗜热革节孢(Scytalidium thermophilum)内切葡聚糖酶Ⅱ(endoglucanaseⅡ,EGⅡ)的第159位组氨酸(His159)在糖苷水解酶第五家族中是高度保守的,但其在酶催化中的作用尚不清楚。
【基金项目】
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国家科技支撑计划(No.2015BAD15B05);国家高技术研究发展计划(863)项目(No.2012AA10180402);国家自然科学基金项目(No.31571949)
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嗜热革节孢(Scytalidium thermophilum)内切葡聚糖酶Ⅱ(endoglucanaseⅡ,EGⅡ)的第159位组氨酸(His159)在糖苷水解酶第五家族中是高度保守的,但其在酶催化中的作用尚不清楚。本研究将His159分别突变为丙氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、色氨酸和酪氨酸,突变酶H159A、H159D、H159F、H159R、H159W和H159Y与原始酶(wild type,WT)在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达,经亲和层析纯化后进行特性分析。结果表明,6个突变酶的米氏常数(Km)均高于WT,突变酶H159D、H159F、H159R、H159W和H159Y的催化常数(kcat)降低,但H159A的kcat有显著提高(P<0.05)。WT的最适反应温度为70℃,突变酶H159A、H159D和H159F最适温度为60℃,H159R、H159W和H159Y最适温度为55℃。突变酶H159A在60℃10 min处理后有80%以上的活性,突变酶H159D和H159W的热稳定性明显下降,突变酶H159F、H159R和H159Y在60℃处理10 min几乎丧失全部活性。上述研究结果表明,159位的组氨酸与酶的活性和热稳定性有密切关系。本研究在前人研究的基础上,对保守位点His159进行定点突变和性质测定与比较,获得了更具体的数据,进一步分析H159氨基酸影响酶活性的分子与结构机制,为下一步的纤维素酶的分子改造提供参考。
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