【摘 要】
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目的 优化二代CD19嵌合抗原受体(CD19-CAR)逆转录病毒载体对人原代T细胞的转染效率.方法 应用重组DNA技术将CD 19-CAR构建入逆转录病毒载体,转入plat-A包装细胞收集病毒上清
【机 构】
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200433 上海,第二军医大学附属长海医院血液科,全军血液病研究所复旦大学生命科学学院遗传学研究所;第二军医大学附属长海医院输血科, 上海,200433;
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目的 优化二代CD19嵌合抗原受体(CD19-CAR)逆转录病毒载体对人原代T细胞的转染效率.方法 应用重组DNA技术将CD 19-CAR构建入逆转录病毒载体,转入plat-A包装细胞收集病毒上清并转染人原代T细胞及K562细胞系,采用流式细胞术检测不同条件下的转染效率,用RT-PCR方法检测目的基因的表达情况,用ELISA法检测IFN-γ、TNF-α表达水平.结果 ①MigR1-CD 19-CAR逆转录病毒载体成功构建后包装高滴度逆转率病毒;②相同条件下,MigR1-CD 19-CAR逆转录病毒对K562细胞系转染效率显著高于T细胞;③对T细胞,离心120 min组的转染率为(54.5±14.6)％,明显高于未离心组、离心30 min组及离心60 min组(P值均＜0.05);④CD3/CD28磁珠与rhIL-2联合对人T细胞活化扩增效率个体差异显著,根据扩增倍数优化个体转染时机可提高转染效率(最高达69.3％),且RT-PCR检测证实CD 19-CAR目的基因在转染后72 hT细胞中高效特异性转录;⑤CD19-CAR-T细胞与CD19-K562细胞共培养组IFN-γ、TNF-α表达水平均增加,分别为(13 230±1 543)pg/ml、(4 217±211)pg/ml,与阴性对照组比较差异均有统计学意义(P值均＜0.01).结论 通过MigR1-CD 19-CAR逆转录病毒载体转染人原代T细胞,并通过延长离心转染时间、根据扩增倍数确定个体转染时机而成功优化转染效率,RT-PCR检测CD 19-CAR目的基因在转染后人T细胞中高效特异性转录,CD 19-CAR-T细胞特异性识别靶细胞引发IFN-γ、TNF-α表达水平增加.
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