【摘 要】
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目的 构建MEK2-siRNA表达质粒,转染胶质瘤U87细胞并研究其对内源性MEK2表达的敲减效果.方法 化学合成4条60个碱基并能转录siRNA发卡结构的DNA寡核苷酸,退火形成2条双链DNA,以
【机 构】
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上海,干细胞与医学研究生创新实验中心,第二军医大学长征医院神经外科
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目的 构建MEK2-siRNA表达质粒,转染胶质瘤U87细胞并研究其对内源性MEK2表达的敲减效果.方法 化学合成4条60个碱基并能转录siRNA发卡结构的DNA寡核苷酸,退火形成2条双链DNA,以T4连接酶接入BglⅡ和HindⅢ双酶切后的pSUPER.basic载体中.EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定出阳性重组克隆,抽提质粒并转染胶质瘤U87细胞,Western blotting检测MEK2蛋白的表达水平.结果 酶切鉴定和测序结果表明MEK2-siRNA质粒构建成功,Western blotting结果筛选出较好的MEK2-siRNA质粒.未转染阴性对照质粒MEK2表达水平为0.105±0.023,转染筛选质粒后表达水平为0.030±0.006.结论 成功构建了MEK2-siRNA真核表达载体,并证明其能下调胶质瘤U87细胞中MEK2蛋白的表达水平,为RNA干扰技术应用于胶质瘤的基因治疗提供了一定的实验依据.
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