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摘要 [目的]寻求操作简单、高效的苜蓿二胺氧化酶（DAO）纯化方法。[方法]苜蓿种子黑暗培养3 d，幼苗依次经硫酸铵沉淀，葡聚糖凝胶G-100（sephadex G-100），DEAE-纤维素以及羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）层析分离纯化，最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳。[结果]最佳分段盐析的硫酸铵饱和度为20%～50%。经一系列层析分离后酶液比活力达84.67 U/mg，回收率为26%。经非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后，出现1个蛋白质条带，相对分子质量约为110 kDa。而在变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后，出现2个蛋白质条带，相对分子质量约为55和40 kDa。[结论]苜蓿DAO是由2个大小不同的亚基组成的异源二聚体。
关键词 苜蓿；二胺氧化酶；分离纯化
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0144-02
Abstract [Objective]To seek a simple and efficient method for purifying the diamine oxidase from alfalfa. [Method] Alfalfa seeds were cultured in darkness for 3 days. The seedlings were isolated and purified by ammonium sulfate precipitation， dextran gel G100 （sephadex G100）， DEAEcellulose and hydroxyapatite （HAP），finally， polyacrylamide gel electrophoresis. [Result] The best fraction of salting out ammonium sulfate saturation was 20%-50%. After a series of chromatographic separation， the specific activity of the enzyme reached 84.67 U/mg， and the recovery rate was 26%. After the nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis， a protein band appeared with a relative molecular mass of about 110 kDa.But after denaturing polyacrylamide gel electrophoresis， two protein bands appeared at a relative molecular mass of about 55 kDa and 40 kDa. [Conclusion] Diamine oxidase from alfalfa is a heterodimer composed of two subunits of different sizes.
Key words Alfalfa；Diamine oxidase；Separation and purification
二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）是一种能催化二胺底物如腐胺和尸胺氧化能力的酶，属于含铜胺氧化酶。在豌豆、鹰嘴豆、扁豆和大豆等豆科类植物中，二胺氧化酶是较丰富的细胞壁可溶性蛋白质，其活性受光敏素的控制[1]。在豆科植物幼苗生长期、机械损伤的响应期及病原菌入侵期，二胺氧化酶活性与过氧化氢酶有功能性联系[2]。
目前有关苜蓿二胺氧化酶的研究国内外鲜见报道。笔者拟对苜蓿幼苗二胺氧化酶进行分离纯化，旨在为研究该酶的结构及酶学性质奠定基础，同时寻求操作简单、实用及高效的纯化方法。
1 材料与方法
1.1 材料
苜蓿種子购置于东京丸种公司（日本），以黑暗条件下生长3 d的苜蓿幼苗为酶液提取材料。
1.2 DAO活性测定
DAO活性测定采用稍作改进的Awal和Hirasawa法[3]。
1.3 蛋白质含量测定
使用Folin-酚法检测酶液蛋白质含量。
1.4 粗酶液的提取
称取50 g苜蓿黄化苗，加入50 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.0），放入匀浆机内粉碎。过滤，滤液在4 ℃、12 000 r/min离心20 min，得粗酶提取液。
1.5 DAO的分离纯化
经盐析得到沉淀物，然后用磷酸缓冲液对沉淀物进行溶解，再次离心得粗酶上清液。粗酶上清液依次用葡聚糖凝胶G-100（sephadex G-100）、DEAE-纤维素以及羟基磷灰石（Hydroxyapatite）层析柱进行分离纯化。每次过柱后用分光光度法进行酶活性测定及用Folin-酚法测定蛋白含量。对纯化后的酶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），确定苜蓿二胺氧化酶的纯化度和相对分子质量。
2 结果与分析
2.1 硫酸铵沉淀
从图1可以看出，用硫酸铵分级沉淀粗酶液，饱和度20%～30%至20%～50%时，DAO酶活力增加，饱和度为30%～40%、30%～50%、40%～50%时，DAO酶活力减小。硫酸铵饱和度为20%～50%时，DAO酶活力高。通过查阅文献和材料分析，最终选定硫酸铵饱和法除去杂蛋白，且酶的比活性及产率都较高。
2.2 层析分离
将硫酸铵饱和法得到的沉淀用磷酸钾缓冲液溶解，并再次离心提取上清液。上清液依次用葡聚糖凝胶G-100（sephadex G-100），DEAE-纤维素以及羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）层析分离，结果见表1。分离纯化过程中，酶活力逐渐降低，比活力逐渐升高，且在经羟基磷灰石柱层析后比活力达到了硫酸铵沉淀后的8倍，这对获得电泳均一的酶蛋白是必要的。 2.3 电泳 对分离纯化得到的苜蓿酶液进行变性和非变性条件下的不连续聚丙烯酰氨凝胶电泳，对其DAO纯度和相对分子质量进行确定。采用Laemmli法（1970年）进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据低分子标准蛋白质分子量的对数（lgMW）与Rf值的线性关系，绘制标准蛋白曲线（图2）。在非变性聚丙烯酰凝胶电泳后，出现1个蛋白质条带，相对分子质量约为110 kDa（图3a）。而在变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后，出现2个蛋白质条带，相对分子质量约为55 kDa和40 kDa（图3b、c）。这说明苜蓿DAO是由大小不同的2个亚基组成的异源二聚体。而在其他豆科植物（如豌豆和蚕豆）的研究中发现，DAO均由2个亚基组成，但2个亚基的结构是相同的，每个亚基都含1个Cu2+（豌豆幼苗DAO还存在多
巴醌辅助因子），并且2个亚基共用1个羰基，这说明不同物种的DAO在结构上存在较大差异[4-6]。
3 结论
研究表明，采用不同饱和度的硫酸铵进行分段沉淀杂蛋白质时，盐析最佳分段的硫酸铵饱和度为20%～50%；匀浆粗提取液酶活力为225.98 U，蛋白质含量为77.0 mg，经硫酸铵沉淀后，酶活力为135.21 U，蛋白质含量为13.00 mg，酶液回收率为60%；葡聚糖凝胶G-100洗脱后，酶活力为104.65 U，蛋白质含量为8.0 mg，酶液回收率为46%；再经DEAE-纤维素柱层析后，酶活力为85.20 U，蛋白质含量为3.0 mg，酶液回收率为37%；最后经羟基磷灰石柱层析洗脱分离后，酶活力为59.27 U，蛋白质含量为0.7 mg，酶液回收率为26%；经非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后，出现1个蛋白质条带，其相对分子质量约为110 kDa；而在变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后，出现2个蛋白质条带，其相对分子质量约为55 kDa和40 kDa。结果表明苜蓿DAO是异源二聚体，由2个大小不同的亚基组成。
参考文献
[1] 胡文婷.多胺氧化降解在大豆子叶节分化形成不定芽和不定根中的作用[D].苏州：苏州大学，2012.
[2] 王明祖，何生根，杨暹.菜豆多胺氧化酶的分离提纯及催化性质研究[J].仲恺农业技术学院学报，2007，20（1）：9-12.
[3] AWAL H M A，HIRASAWA E J.Diamine oxidase from millet catalyzes the oxidation of 1，3-diaminopropane[J].Journal of plant research，1995，108（3）：395-397.
[4] 苏国兴，刘友良.高等植物体内的多胺分解代谢及其主要产物的生理作用[J].植物學通报，2005，22（4）：408-418.
[5] 王萍，周锋，周元娇.基因型对诱导大豆子叶节不定芽的影响[J].淮海工学院学报（自然科学版），2012，21（3）：71-74.
[6] 张永明，平泽栄次.四种禾本科植物幼苗中单胺氧化酶的分离与纯化[C]//留日中国人生命科学协会第13回学术交流会论文集.[出版地不详]：[出版者不详]，2011：42-43.
关键词 苜蓿；二胺氧化酶；分离纯化
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0144-02
Abstract [Objective]To seek a simple and efficient method for purifying the diamine oxidase from alfalfa. [Method] Alfalfa seeds were cultured in darkness for 3 days. The seedlings were isolated and purified by ammonium sulfate precipitation， dextran gel G100 （sephadex G100）， DEAEcellulose and hydroxyapatite （HAP），finally， polyacrylamide gel electrophoresis. [Result] The best fraction of salting out ammonium sulfate saturation was 20%-50%. After a series of chromatographic separation， the specific activity of the enzyme reached 84.67 U/mg， and the recovery rate was 26%. After the nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis， a protein band appeared with a relative molecular mass of about 110 kDa.But after denaturing polyacrylamide gel electrophoresis， two protein bands appeared at a relative molecular mass of about 55 kDa and 40 kDa. [Conclusion] Diamine oxidase from alfalfa is a heterodimer composed of two subunits of different sizes.
Key words Alfalfa；Diamine oxidase；Separation and purification
二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）是一种能催化二胺底物如腐胺和尸胺氧化能力的酶，属于含铜胺氧化酶。在豌豆、鹰嘴豆、扁豆和大豆等豆科类植物中，二胺氧化酶是较丰富的细胞壁可溶性蛋白质，其活性受光敏素的控制[1]。在豆科植物幼苗生长期、机械损伤的响应期及病原菌入侵期，二胺氧化酶活性与过氧化氢酶有功能性联系[2]。
目前有关苜蓿二胺氧化酶的研究国内外鲜见报道。笔者拟对苜蓿幼苗二胺氧化酶进行分离纯化，旨在为研究该酶的结构及酶学性质奠定基础，同时寻求操作简单、实用及高效的纯化方法。
1 材料与方法
1.1 材料
苜蓿種子购置于东京丸种公司（日本），以黑暗条件下生长3 d的苜蓿幼苗为酶液提取材料。
1.2 DAO活性测定
DAO活性测定采用稍作改进的Awal和Hirasawa法[3]。
1.3 蛋白质含量测定
使用Folin-酚法检测酶液蛋白质含量。
1.4 粗酶液的提取
称取50 g苜蓿黄化苗，加入50 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.0），放入匀浆机内粉碎。过滤，滤液在4 ℃、12 000 r/min离心20 min，得粗酶提取液。
1.5 DAO的分离纯化
经盐析得到沉淀物，然后用磷酸缓冲液对沉淀物进行溶解，再次离心得粗酶上清液。粗酶上清液依次用葡聚糖凝胶G-100（sephadex G-100）、DEAE-纤维素以及羟基磷灰石（Hydroxyapatite）层析柱进行分离纯化。每次过柱后用分光光度法进行酶活性测定及用Folin-酚法测定蛋白含量。对纯化后的酶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），确定苜蓿二胺氧化酶的纯化度和相对分子质量。
2 结果与分析
2.1 硫酸铵沉淀
从图1可以看出，用硫酸铵分级沉淀粗酶液，饱和度20%～30%至20%～50%时，DAO酶活力增加，饱和度为30%～40%、30%～50%、40%～50%时，DAO酶活力减小。硫酸铵饱和度为20%～50%时，DAO酶活力高。通过查阅文献和材料分析，最终选定硫酸铵饱和法除去杂蛋白，且酶的比活性及产率都较高。
2.2 层析分离
将硫酸铵饱和法得到的沉淀用磷酸钾缓冲液溶解，并再次离心提取上清液。上清液依次用葡聚糖凝胶G-100（sephadex G-100），DEAE-纤维素以及羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）层析分离，结果见表1。分离纯化过程中，酶活力逐渐降低，比活力逐渐升高，且在经羟基磷灰石柱层析后比活力达到了硫酸铵沉淀后的8倍，这对获得电泳均一的酶蛋白是必要的。 2.3 电泳 对分离纯化得到的苜蓿酶液进行变性和非变性条件下的不连续聚丙烯酰氨凝胶电泳，对其DAO纯度和相对分子质量进行确定。采用Laemmli法（1970年）进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据低分子标准蛋白质分子量的对数（lgMW）与Rf值的线性关系，绘制标准蛋白曲线（图2）。在非变性聚丙烯酰凝胶电泳后，出现1个蛋白质条带，相对分子质量约为110 kDa（图3a）。而在变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后，出现2个蛋白质条带，相对分子质量约为55 kDa和40 kDa（图3b、c）。这说明苜蓿DAO是由大小不同的2个亚基组成的异源二聚体。而在其他豆科植物（如豌豆和蚕豆）的研究中发现，DAO均由2个亚基组成，但2个亚基的结构是相同的，每个亚基都含1个Cu2+（豌豆幼苗DAO还存在多
巴醌辅助因子），并且2个亚基共用1个羰基，这说明不同物种的DAO在结构上存在较大差异[4-6]。
3 结论
研究表明，采用不同饱和度的硫酸铵进行分段沉淀杂蛋白质时，盐析最佳分段的硫酸铵饱和度为20%～50%；匀浆粗提取液酶活力为225.98 U，蛋白质含量为77.0 mg，经硫酸铵沉淀后，酶活力为135.21 U，蛋白质含量为13.00 mg，酶液回收率为60%；葡聚糖凝胶G-100洗脱后，酶活力为104.65 U，蛋白质含量为8.0 mg，酶液回收率为46%；再经DEAE-纤维素柱层析后，酶活力为85.20 U，蛋白质含量为3.0 mg，酶液回收率为37%；最后经羟基磷灰石柱层析洗脱分离后，酶活力为59.27 U，蛋白质含量为0.7 mg，酶液回收率为26%；经非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后，出现1个蛋白质条带，其相对分子质量约为110 kDa；而在变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后，出现2个蛋白质条带，其相对分子质量约为55 kDa和40 kDa。结果表明苜蓿DAO是异源二聚体，由2个大小不同的亚基组成。
参考文献
[1] 胡文婷.多胺氧化降解在大豆子叶节分化形成不定芽和不定根中的作用[D].苏州：苏州大学，2012.
[2] 王明祖，何生根，杨暹.菜豆多胺氧化酶的分离提纯及催化性质研究[J].仲恺农业技术学院学报，2007，20（1）：9-12.
[3] AWAL H M A，HIRASAWA E J.Diamine oxidase from millet catalyzes the oxidation of 1，3-diaminopropane[J].Journal of plant research，1995，108（3）：395-397.
[4] 苏国兴，刘友良.高等植物体内的多胺分解代谢及其主要产物的生理作用[J].植物學通报，2005，22（4）：408-418.
[5] 王萍，周锋，周元娇.基因型对诱导大豆子叶节不定芽的影响[J].淮海工学院学报（自然科学版），2012，21（3）：71-74.
[6] 张永明，平泽栄次.四种禾本科植物幼苗中单胺氧化酶的分离与纯化[C]//留日中国人生命科学协会第13回学术交流会论文集.[出版地不详]：[出版者不详]，2011：42-43.