【摘 要】
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目的构建并鉴定蛋白激酶C受体1(RACK1)过表达及干扰真核表达载体。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人肝癌细胞系Huh-7.5.1中扩增RACK1全长cDNA系列,用巢式PCR扩增对应
【机 构】
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昆明理工大学,中国人民解放军昆明总医院,云南省第一人民医院
【基金项目】
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云南省应用基础研究计划项目(2011FB216)
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目的构建并鉴定蛋白激酶C受体1(RACK1)过表达及干扰真核表达载体。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人肝癌细胞系Huh-7.5.1中扩增RACK1全长cDNA系列,用巢式PCR扩增对应的CDS,并将其克隆到PIRES2-EGFP,PCR鉴定后进行测序分析。以人RACK1基因为靶基因,设计合成两对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴性对照序列,退火后与酶切后的载体RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen进行连接,并行酶切分析和测序鉴定。将构建好的过表达载体和干扰载体用脂质体转染HUVEC细胞系。结果两对引物PCR扩增的序列大小与预期结果一致,PIRES2-EGFP/RACK1载体954个碱基成功插入到预计位点,序列完全一致。RNA干扰载体pRetroQ/RACK1-1、pRetroQ/RACK1-2和pRetroQ/HK插入序列均与预计相符。荧光显微镜观察,转染的HUVEC细胞均表达EGFP和GFP。结论成功构建RACK1过表达载体及其RNA干扰载体,并可被成功导入HUVEC细胞系。
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