探讨脑出血后游离血红素对神经元死亡的影响及其可能的分子机制。
方法(1)实验一：将24只C57BL/6小鼠按随机数字表法分为假手术组、生理盐水组、5 mmol/L血红素组、10 mmol/L血红素组，每组6只。后2组分别注射20 μL 5 mmol/L、10 mmol/L血红素溶液至纹状体制备成脑出血模型，生理盐水组注射20 μL生理盐水。12 h后采用Western blotting检测海马组织中血红素氧合酶-1(HO-1)及受体间相互作用蛋白(RIP)1、RIP3、混合谱系激酶域样蛋白(MLKL)的蛋白表达。将3只C57BL/6小鼠注射20 μL 10 mmol/L血红素溶液至纹状体制备成脑出血模型，24 h后采用免疫荧光双标染色检测海马组织冰冻切片上神经元特异性核蛋白(NeuN)和半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达。(2)实验二：将原代培养的海马神经元分别用0、10、20、40、80 μmol/L血红素刺激6 h后及用40 μmol/L血红素刺激0、1、2、4、6 h后，采用乳酸脱氢酶(LDH)法检测神经元毒性损伤情况。将原代培养的海马神经元分别用40 μmol/L血红素刺激0、1、2、4、6 h后，采用Western blotting检测神经元中白介素-1(IL-1)受体(IL-IR)1、RIP1、RIP3、MLKL及Caspase-3的蛋白表达，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测白介素-1β(IL-1β)水平。将原代培养的海马神经元分别用0、40 μmol/L血红素刺激6 h后，采用免疫荧光双标染色检测神经元中NeuN和Caspase-3的表达。(3)实验三：将原代培养的海马神经元分别用0、0.5、1.0、1.5 μg/mL IL-IR拮抗剂预孵育1 h后再用40 μmol/L血红素刺激6 h后，采用LDH法检测神经元毒性损伤情况，采用Western blotting检测神经元中IL-IR1、RIP1、RIP3、MLKL的蛋白表达。
结果(1)实验一：与假手术组、生理盐水组比较，5 mmol/L血红素组、10 mmol/L血红素组HO-1、RIP1、RIP3、MLKL蛋白表达均明显增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。10 mmol/L血红素注射后24 h时的小鼠海马组织冰冻切片上Caspase-3有明显表达，但未发现Caspase-3和NeuN存在共定位。(2)实验二：与0 μmol/L血红素组比较，不同浓度血红素组LDH释放率呈浓度依赖性明显增高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与刺激0 h组比较，40 μmol/L血红素刺激不同时间组LDH释放率呈时间依赖性明显增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与刺激0 h组比较，40 μmol/L血红素刺激不同时间组IL-1R1、RIP1、RIP3、MLKL的蛋白表达均明显增高，差异均有统计学意义(P<0.05)，但Caspase-3的蛋白表达无明显变化。与刺激0 h组比较，40 μmol/L血红素刺激不同时间组IL-1β水平呈时间依赖性明显增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。40 μmol/L血红素刺激6 h后的海马神经元中未见Caspase-3明显表达。(3)实验三：与40 μmol/L血红素组比较，各预孵育IL-1R拮抗剂组LDH释放率及IL-1R1、RIP1、RIP3、MLKL的蛋白表达均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。
结论脑出血后游离血红素可通过IL-1R诱导神经元发生程序性坏死而非Caspase-3介导的凋亡，阻断IL-1R表达则可抑制该情况。