【摘 要】
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目的探讨酪氨酸激酶JAK2转基因骨髓造血干/祖细胞体外长期扩增调控和定向分化潜能的可行性.方法克隆了一个MSCV-based逆转录病毒载体称作MGI-F2Jak2,它编码一个绿色荧光蛋白(
【机 构】
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北京医院血液科,ARIAD Pharmaceuticals,Division of Hematology
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目的探讨酪氨酸激酶JAK2转基因骨髓造血干/祖细胞体外长期扩增调控和定向分化潜能的可行性.方法克隆了一个MSCV-based逆转录病毒载体称作MGI-F2Jak2,它编码一个绿色荧光蛋白(GFP)和两个改进的FK506结合蛋白(F36v)与JAK2组成的融合蛋白,F36v是二聚化化学诱导物AP20187的结合位点.应用该载体转染GpE+86包装细胞株,将C57BL/6小鼠的骨髓细胞与照射过1 500 cGy的GpE+86产毒细胞株共同培养实现基因转导.转导后的细胞在X-VIVO 15培养体系中扩增,分为①空白对照组;②AP20187组;③干细胞因子(SCF)组;④AP20187+SCF组.扩增的细胞用直接法标记藻红蛋白荧光素(PE)结合的抗Sca1、c-kit、CD34、Gr1、CD11b、TER119、CD41、B220和CD3单克隆抗体以流式细胞仪检测,并进行定向分化、祖细胞集落培养和脾细胞集落形成单位(CFU-S)的研究.结果只有AP20187+SCF组可以持续地使转基因的骨髓造血干/祖细胞大量增殖,扩增80 d后细胞可达1014倍,细胞倍增时间约30 h,扩增细胞的表型为CD34、c-kit和Scal等干细胞表面标志强阳性,其它细胞表面标志如Gr1、CD11b、TER119、CD41、B220、CD3接近阴性.所扩增的细胞在不同的细胞因子组合下,可定向分化为粒细胞、巨噬细胞、红细胞、B淋巴细胞和明显的巨核细胞;甲基纤维素半固体培养条件下可形成BFU-E、CFU-GM、CFU-Mix;扩增3个月以上的细胞仍可形成CFU-S.结论AP20187联合SCF激活JAK2信号,可以大量扩增造血干/祖细胞,所扩增的细胞可以调控并具有定向分化的潜能.该系统有助于研究干细胞生物学,并可在细胞和基因治疗中得到应用.
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