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摘 要：目的：气相色谱-三重四级杆串联质谱法（GC-MS/MS）测定芹菜中毒死蜱含量的不确定度评定。方法：通过建立不确定度评估数学模型，对标准溶液制备、样品称量、样品前处理、校准方法、样品重复性测量以及空白样品加标回收测定等主要不确定度分量进行分析，评定芹菜中毒死蜱残留量测定过程不确定度。结果：当芹菜中毒死蜱的含量测定结果为0.048 mg/kg时，在95%的置信区间下，扩展不确定度为0.003 mg/kg，毒死蜱残留量可表示为（0.048±0.003）mg/kg，k=2，并确定了贡献率最大的不确定度分量为标准溶液配制与标准曲线拟合。结论：该评定方法可用于GC-MS/MS法测定芹菜中毒死蜱残留量的不确定评定。
关键词：GC-MS/MS;芹菜;毒死蜱;不确定度;评定
近年来，伴随着农业经济的高速发展，农药残留问题已成为影响人们生活质量的重大问题，农药施用后残存于周围土壤及水体环境中，不仅会毒害藻类、鱼类等水生生物，农药原药或其在动物体内的代谢物还会通过食物链间接进入人体，影响人体健康[1-2]。毒死蜱是一种毒性强、半衰期长，且被广泛用于芹菜、菠菜等叶菜类虫害防治的有机磷类杀虫剂，芹菜中毒死蜱残留量的食品安全国家标准限量为不得超过0.05 mg/kg，从近些年国家监督抽检结果中不难发现，芹菜中毒死蜱超量使用问题屡见不鲜，在实际的检测工作中，样品检出结果在国家规定限量值附近是比较常见的问题，此时对检验方法的准确度进行更为科学的评价尤为重要[3-5]。自1999年我国首次将测量不确定度评定纳入计量技术规范以来，其在检验检测行业的应用逐渐开展，目前，RB/T214—2017、CNAS-CL01：2018等检测、校准准则中均要求在数据出现临界值时，需要对检验方法进行测量不确定度评定[6-11]。本研究建立的GC-MS/MS法测定芹菜中毒死蜱残留量的方法，具有较好的选择性和灵敏度，并可适用于复杂样品的分析，在建立检验方法的基础上，参考相关规范和指南[12-14]对芹菜中毒死蜱残留量测定进行不确定度评定，确定影响结果的主要不确定度分量，为检测数据的可靠性提供参考。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
GC-MS/MS 7000D气相色谱三重四级杆串联质谱联用仪，美国安捷伦公司;均质器，上海精科;离心机H1850，湖南湘仪;十万分之一电子天平MS105DU，梅特勒-托利多;AUY120型电子天平，岛津菲律宾工厂;移液器（20 μL），Eppendorf。
毒死蜱对照品（纯度为99.7%），SITAER;环氧七氯B对照品（浓度为100 μg/mL，溶剂为正己烷），信阳市中检计量生物科技有限公司;乙腈（色谱纯），霍尼韦尔;乙酸乙酯（色谱纯），霍尼韦尔;无水硫酸镁、乙酸钠，天津博纳艾杰尔;净化管（含1.2 g硫酸镁、0.4 g PSA），天津博纳艾杰尔;氯化钠（优级纯），默克;芹菜为市售品。
1.2 标准溶液的配制
毒死蜱标准溶液。称取毒死蜱对照品0.010 03 g置100 mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀释为100 μg/mL的毒死蜱标准溶液。内标使用液。吸取内标溶液0.50 mL置10 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀释为5.00 μg/mL的环氧七氯B内标使用液。
标准系列溶液。吸取毒死蜱标准溶液1 mL置100 mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋为1.00 μg/mL的标准溶液，从中分别吸取0.50 mL、1.00 mL、5.00 mL、10.00 mL和20.00 mL于10 mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀释为5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、50.00 ng/mL、100.00 ng/mL和200.00 ng/mL的标准系列溶液。
基质工作溶液。将空白基质溶液氮气吹干，加入20 μL内标使用溶液，分别加1 mL的5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、50.00 ng/mL、100.00 ng/mL和200.00 ng/mL的标准溶液复溶空白基质，即得。
1.3 供试品溶液的制备
取芹菜500 g，搅碎均质后，混合均匀，精密称取10 g匀浆试样于50 mL离心管中，精密加入20 mL乙腈，再加入6 g硫酸镁、1.5 g乙酸钠、1 g氯化钠，涡旋1 min，8 000 r/min离心5 min。取上清液10 mL于净化管（含1.2 g硫酸镁、0.4 g PSA），涡旋1 min，8 000 r/min离心5 min，精密取5 mL上清液，于40 ℃水浴中氮气吹至近干。精密加入1 mL乙酸乙酯复溶，加入20 μL内标使用溶液，混匀，过0.22 μm滤膜，待测定。同时进行空白实验。
1.4 分析条件
气相色谱条件。色谱柱：VF1701-ms（0.25 mm×30 m，0.25 μm）;色谱柱温度：40 ℃保持1 min，以40 ℃/min升温至120 ℃，再以5 ℃/min升温至240 ℃，再以12 ℃/min升温至300 ℃，保持6 min;氦气流速：1.0 mL/min;进样口温度：280 ℃;进样量：1 μL;进样方式，不分流进样。
质谱条件。离子源：电子轰击源（EI）;离子源温度：230 ℃;接口温度：280 ℃：溶剂延迟时间：4 min;扫描方式：多反应监测（MRM）;定性定量离子对见表1。
2 结果与分析
2.1 测量模型
芹菜中毒死蜱含量的计算：
式中：X-毒死蜱的含量，mg/kg;c-试样中毒死蜱的浓度，ng/mL;V-样液最终定容体积，mL;m-称取试样的质量，g;f-试样稀释倍数。
2.2 测量不确定度的来源
根据建立的测量模型及样品的测定过程，芹菜中毒死蜱的不确定度引入来源主要为：①对照品及对照品溶液配制urel（S）;②样品称量urel（M）;③样品前处理过程urel（V）;④校准方法urel（X）;⑤样品重复性测定urel（rep）;⑥空白样品加标回收测定urel（R）。 2.3 各标准不确定度分量的评定
2.3.1 毒死蜱对照品及其配制过程引入的相对标准不确定度urel（S）的评定
对照品及对照品溶液配制过程引入的不确定度由对照品自身不确定度，电子天平称量引入的不确定度，以及标准溶液逐级稀释过程所用量器引入。
（1）对照品引入的不确定度ur（S1）。由标准物质证书得知，测量所用毒死蜱标准物质的纯度为99.7%，扩展不确定度为±2.0%，k=2，按照均匀分布，其相对标准不确定度为：
（2）对照品称量引入的不确定度ur（S2）。根据《电子天平检定规程》（JJG 1036—2008）[15]以及方法称量质量，对照品称量所用天平（十万分之一）最大允许误差为±0.000 005 g，按均匀分布，取包含因子k=，称取的对照品质量为0.010 03 g。
（3）标准溶液配制引入的不确定度ur（S3）。标准溶液稀释过程的不确定度主要由所用量器的容量允差以及温度引起体积变化引入。所用玻璃量器按照《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[16]检定，其容量允差均符合A级标准。基质曲线配制过程使用移液器加入内标，按照《移液器检定规程》（JJG 646—2006）检定，所用移液器（规格为20 μL），当量取体积为20 μL时其容量允许误差为4.0%，容量允差即为20 μL×4.0%=0.000 8 mL。
按均匀分布，取包含因子k=，容量允差引入的不确定度按照式1计算：（1）;在（20±5） ℃环境温度下，水膨胀系数为0.000 21/℃（20 ℃），溶液配制时，温度引起的标准不确定度参照均匀分布按式2计算：（2）;在标准溶液配制过程中，容量瓶及移液管等量器引入的相对标准不确定度按照式3计算：（3）;标准系列溶液稀释过程使用的量器、使用次数、实际使用体积（V）及不确定度计算见表2。
量器引入的相对标准不确定度ur（S3）：
（4）对照品及对照品溶液配制过程引入的相对标准不确定度urel（S）：
2.3.2 样品称量引入的相对标准不确定度urel（M）的评定
样品测定过程中共使用天平（万分之一）称量2次，根据《电子天平检定规章》（JJG 1036—2008）以及方法称量质量，天平最大允许误差为±0.000 15 g，称取的样品质量分别为10.015 1 g、10.007 4 g，按均匀分布，取包含因子k=。
2.3.3 样品前处理过程带来的不确定度urel（V）评定
操作过程所用玻璃量具均为A级，评定过程同2.3.1（3），样品前处理过程所用量器及具体不确定度计算见表3。
样品前处理过程所用量器带来的不确定度为：
2.3.4 标准工作曲线拟合引入的相对标准不确定度urel（X）
以标准溶液中待测物与内标物浓度比作为横坐标，标准溶液中待测物峰面积与内标物峰面积比值的平均值作为纵坐标，拟合生成线性回归方程。
标准工作曲线拟合引入的相对标准不确定度按照公式4计算：
式中：p-试样连续测定的次数;n-标准溶液测定次数;k-回归系数;c-试样平均浓度;c-标准溶液浓度平均值;ci-标准溶液各个工作液浓度;a-标准曲线斜率。其中，SR为标准曲线残差的标准差，是曲線拟合过程主要的不确定度来源，SR计算见式5：
式中：Yi-标准溶液各个响应值与内标物响应值比值;
a-标准曲线斜率;Xi-标准溶液各点外标与内标物浓度比值;b-截距;n-标准溶液测定次数。
本研究用内标法定量，将标准曲线每个浓度点进样1次，得到相应峰面积之比，结果见表4。由表4可知，试验得到标准曲线：Y=12.881 7x+0.148 1，相关系数r=0.999 8，将表4中数据代入式4、式5，得ur（X）=0.020 58，SR=0.233 9，芹菜样品测定外标与内标浓度之比为1.20，标准工作曲线拟合引入的相对标准不确定度urel（X）=0.017 15。
2.3.5 重复性实验引入的相对标准不确定度urel（rep）的评定
样品测量重复性测定引入的不确定度为A类评定，取待测样品，按样品制备方法重复进行6次测定，不确定度参照式6计算，测定结果见表5。
2.3.6 空白样品加标回收引入相对标准不确定度urel（R）的评定
在6份空白样品中均加入浓度为1 μg/mL的毒死蜱标准溶液0.5 mL，按照上述方法测定，毒死蜱的回收率测定结果见表6。
6次回收率测定结果的标准偏差为S=2.139 7%，回收率平均值R=91.47%，空白基质加标回收引入的相对标准不确定度计算结果如式7：
2.4 不确定度的合成
影响芹菜中毒死蜱残留量测定的各不确定度分量中，对照品及对照品溶液配制不确定度最大，标准曲线拟合次之，具体结果见表7。
2.5 扩展不确定度U及结果表示
采用GC-MS/MS测定芹菜中毒死蜱残留量，当样品中毒死蜱含量为0.048 mg/kg时，其合成标准不确定度=0.048 mg/kg×0.030=0.001 44 mg/kg。根据JJF 1059.1—2012，在95%的置信水平下，取包含因子k=2，扩展不确定度U=0.001 44 mg/kg×2=0.003 mg/kg。因此，毒死蜱残留量可表示为（0.048±0.003）mg/kg，k=2。
3 结论
本研究通过对GC-MS/MS测定芹菜中毒死蜱残留量过程中标准溶液的制备、样品的称量、样品前处理过程所使用的移液管及容量瓶等量器、标准工作曲线校准、样品重复性测定，及空白样品加标回收测定等不确定度来源进行分析考察，结果表明，标准溶液配制及标准曲线拟合引入不确定度最显著，方法加标回收率、样品前处理过程及重复性测试也是不确定度引入的主要来源。因此，可通过增加标准溶液的测定次数，根据样品选择合理的线性范围，增加标准溶液配制过程的移取体积和定容体积以减少标准溶液引入的不确定度，同时也要提高检测人员试验水平、试验回收率以及检测结果的准确性。 参考文献
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[14]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.测量不确定度评定与表示：JJF 1059.1—2012[S].北京：中国标准出版社，2012.
[15]国家质量监督检验检疫总局.电子天平检定规程：JJG 1036—2008[S].北京：中国质检出版社，2008.
[16]国家质量监督检验检疫总局.常用玻璃量器检定规程：JJG 196—2006[S].北京：中国计量出版社，2006.
关键词：GC-MS/MS;芹菜;毒死蜱;不确定度;评定
近年来，伴随着农业经济的高速发展，农药残留问题已成为影响人们生活质量的重大问题，农药施用后残存于周围土壤及水体环境中，不仅会毒害藻类、鱼类等水生生物，农药原药或其在动物体内的代谢物还会通过食物链间接进入人体，影响人体健康[1-2]。毒死蜱是一种毒性强、半衰期长，且被广泛用于芹菜、菠菜等叶菜类虫害防治的有机磷类杀虫剂，芹菜中毒死蜱残留量的食品安全国家标准限量为不得超过0.05 mg/kg，从近些年国家监督抽检结果中不难发现，芹菜中毒死蜱超量使用问题屡见不鲜，在实际的检测工作中，样品检出结果在国家规定限量值附近是比较常见的问题，此时对检验方法的准确度进行更为科学的评价尤为重要[3-5]。自1999年我国首次将测量不确定度评定纳入计量技术规范以来，其在检验检测行业的应用逐渐开展，目前，RB/T214—2017、CNAS-CL01：2018等检测、校准准则中均要求在数据出现临界值时，需要对检验方法进行测量不确定度评定[6-11]。本研究建立的GC-MS/MS法测定芹菜中毒死蜱残留量的方法，具有较好的选择性和灵敏度，并可适用于复杂样品的分析，在建立检验方法的基础上，参考相关规范和指南[12-14]对芹菜中毒死蜱残留量测定进行不确定度评定，确定影响结果的主要不确定度分量，为检测数据的可靠性提供参考。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
GC-MS/MS 7000D气相色谱三重四级杆串联质谱联用仪，美国安捷伦公司;均质器，上海精科;离心机H1850，湖南湘仪;十万分之一电子天平MS105DU，梅特勒-托利多;AUY120型电子天平，岛津菲律宾工厂;移液器（20 μL），Eppendorf。
毒死蜱对照品（纯度为99.7%），SITAER;环氧七氯B对照品（浓度为100 μg/mL，溶剂为正己烷），信阳市中检计量生物科技有限公司;乙腈（色谱纯），霍尼韦尔;乙酸乙酯（色谱纯），霍尼韦尔;无水硫酸镁、乙酸钠，天津博纳艾杰尔;净化管（含1.2 g硫酸镁、0.4 g PSA），天津博纳艾杰尔;氯化钠（优级纯），默克;芹菜为市售品。
1.2 标准溶液的配制
毒死蜱标准溶液。称取毒死蜱对照品0.010 03 g置100 mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀释为100 μg/mL的毒死蜱标准溶液。内标使用液。吸取内标溶液0.50 mL置10 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀释为5.00 μg/mL的环氧七氯B内标使用液。
标准系列溶液。吸取毒死蜱标准溶液1 mL置100 mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋为1.00 μg/mL的标准溶液，从中分别吸取0.50 mL、1.00 mL、5.00 mL、10.00 mL和20.00 mL于10 mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀释为5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、50.00 ng/mL、100.00 ng/mL和200.00 ng/mL的标准系列溶液。
基质工作溶液。将空白基质溶液氮气吹干，加入20 μL内标使用溶液，分别加1 mL的5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、50.00 ng/mL、100.00 ng/mL和200.00 ng/mL的标准溶液复溶空白基质，即得。
1.3 供试品溶液的制备
取芹菜500 g，搅碎均质后，混合均匀，精密称取10 g匀浆试样于50 mL离心管中，精密加入20 mL乙腈，再加入6 g硫酸镁、1.5 g乙酸钠、1 g氯化钠，涡旋1 min，8 000 r/min离心5 min。取上清液10 mL于净化管（含1.2 g硫酸镁、0.4 g PSA），涡旋1 min，8 000 r/min离心5 min，精密取5 mL上清液，于40 ℃水浴中氮气吹至近干。精密加入1 mL乙酸乙酯复溶，加入20 μL内标使用溶液，混匀，过0.22 μm滤膜，待测定。同时进行空白实验。
1.4 分析条件
气相色谱条件。色谱柱：VF1701-ms（0.25 mm×30 m，0.25 μm）;色谱柱温度：40 ℃保持1 min，以40 ℃/min升温至120 ℃，再以5 ℃/min升温至240 ℃，再以12 ℃/min升温至300 ℃，保持6 min;氦气流速：1.0 mL/min;进样口温度：280 ℃;进样量：1 μL;进样方式，不分流进样。
质谱条件。离子源：电子轰击源（EI）;离子源温度：230 ℃;接口温度：280 ℃：溶剂延迟时间：4 min;扫描方式：多反应监测（MRM）;定性定量离子对见表1。
2 结果与分析
2.1 测量模型
芹菜中毒死蜱含量的计算：
式中：X-毒死蜱的含量，mg/kg;c-试样中毒死蜱的浓度，ng/mL;V-样液最终定容体积，mL;m-称取试样的质量，g;f-试样稀释倍数。
2.2 测量不确定度的来源
根据建立的测量模型及样品的测定过程，芹菜中毒死蜱的不确定度引入来源主要为：①对照品及对照品溶液配制urel（S）;②样品称量urel（M）;③样品前处理过程urel（V）;④校准方法urel（X）;⑤样品重复性测定urel（rep）;⑥空白样品加标回收测定urel（R）。 2.3 各标准不确定度分量的评定
2.3.1 毒死蜱对照品及其配制过程引入的相对标准不确定度urel（S）的评定
对照品及对照品溶液配制过程引入的不确定度由对照品自身不确定度，电子天平称量引入的不确定度，以及标准溶液逐级稀释过程所用量器引入。
（1）对照品引入的不确定度ur（S1）。由标准物质证书得知，测量所用毒死蜱标准物质的纯度为99.7%，扩展不确定度为±2.0%，k=2，按照均匀分布，其相对标准不确定度为：
（2）对照品称量引入的不确定度ur（S2）。根据《电子天平检定规程》（JJG 1036—2008）[15]以及方法称量质量，对照品称量所用天平（十万分之一）最大允许误差为±0.000 005 g，按均匀分布，取包含因子k=，称取的对照品质量为0.010 03 g。
（3）标准溶液配制引入的不确定度ur（S3）。标准溶液稀释过程的不确定度主要由所用量器的容量允差以及温度引起体积变化引入。所用玻璃量器按照《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[16]检定，其容量允差均符合A级标准。基质曲线配制过程使用移液器加入内标，按照《移液器检定规程》（JJG 646—2006）检定，所用移液器（规格为20 μL），当量取体积为20 μL时其容量允许误差为4.0%，容量允差即为20 μL×4.0%=0.000 8 mL。
按均匀分布，取包含因子k=，容量允差引入的不确定度按照式1计算：（1）;在（20±5） ℃环境温度下，水膨胀系数为0.000 21/℃（20 ℃），溶液配制时，温度引起的标准不确定度参照均匀分布按式2计算：（2）;在标准溶液配制过程中，容量瓶及移液管等量器引入的相对标准不确定度按照式3计算：（3）;标准系列溶液稀释过程使用的量器、使用次数、实际使用体积（V）及不确定度计算见表2。
量器引入的相对标准不确定度ur（S3）：
（4）对照品及对照品溶液配制过程引入的相对标准不确定度urel（S）：
2.3.2 样品称量引入的相对标准不确定度urel（M）的评定
样品测定过程中共使用天平（万分之一）称量2次，根据《电子天平检定规章》（JJG 1036—2008）以及方法称量质量，天平最大允许误差为±0.000 15 g，称取的样品质量分别为10.015 1 g、10.007 4 g，按均匀分布，取包含因子k=。
2.3.3 样品前处理过程带来的不确定度urel（V）评定
操作过程所用玻璃量具均为A级，评定过程同2.3.1（3），样品前处理过程所用量器及具体不确定度计算见表3。
样品前处理过程所用量器带来的不确定度为：
2.3.4 标准工作曲线拟合引入的相对标准不确定度urel（X）
以标准溶液中待测物与内标物浓度比作为横坐标，标准溶液中待测物峰面积与内标物峰面积比值的平均值作为纵坐标，拟合生成线性回归方程。
标准工作曲线拟合引入的相对标准不确定度按照公式4计算：
式中：p-试样连续测定的次数;n-标准溶液测定次数;k-回归系数;c-试样平均浓度;c-标准溶液浓度平均值;ci-标准溶液各个工作液浓度;a-标准曲线斜率。其中，SR为标准曲线残差的标准差，是曲線拟合过程主要的不确定度来源，SR计算见式5：
式中：Yi-标准溶液各个响应值与内标物响应值比值;
a-标准曲线斜率;Xi-标准溶液各点外标与内标物浓度比值;b-截距;n-标准溶液测定次数。
本研究用内标法定量，将标准曲线每个浓度点进样1次，得到相应峰面积之比，结果见表4。由表4可知，试验得到标准曲线：Y=12.881 7x+0.148 1，相关系数r=0.999 8，将表4中数据代入式4、式5，得ur（X）=0.020 58，SR=0.233 9，芹菜样品测定外标与内标浓度之比为1.20，标准工作曲线拟合引入的相对标准不确定度urel（X）=0.017 15。
2.3.5 重复性实验引入的相对标准不确定度urel（rep）的评定
样品测量重复性测定引入的不确定度为A类评定，取待测样品，按样品制备方法重复进行6次测定，不确定度参照式6计算，测定结果见表5。
2.3.6 空白样品加标回收引入相对标准不确定度urel（R）的评定
在6份空白样品中均加入浓度为1 μg/mL的毒死蜱标准溶液0.5 mL，按照上述方法测定，毒死蜱的回收率测定结果见表6。
6次回收率测定结果的标准偏差为S=2.139 7%，回收率平均值R=91.47%，空白基质加标回收引入的相对标准不确定度计算结果如式7：
2.4 不确定度的合成
影响芹菜中毒死蜱残留量测定的各不确定度分量中，对照品及对照品溶液配制不确定度最大，标准曲线拟合次之，具体结果见表7。
2.5 扩展不确定度U及结果表示
采用GC-MS/MS测定芹菜中毒死蜱残留量，当样品中毒死蜱含量为0.048 mg/kg时，其合成标准不确定度=0.048 mg/kg×0.030=0.001 44 mg/kg。根据JJF 1059.1—2012，在95%的置信水平下，取包含因子k=2，扩展不确定度U=0.001 44 mg/kg×2=0.003 mg/kg。因此，毒死蜱残留量可表示为（0.048±0.003）mg/kg，k=2。
3 结论
本研究通过对GC-MS/MS测定芹菜中毒死蜱残留量过程中标准溶液的制备、样品的称量、样品前处理过程所使用的移液管及容量瓶等量器、标准工作曲线校准、样品重复性测定，及空白样品加标回收测定等不确定度来源进行分析考察，结果表明，标准溶液配制及标准曲线拟合引入不确定度最显著，方法加标回收率、样品前处理过程及重复性测试也是不确定度引入的主要来源。因此，可通过增加标准溶液的测定次数，根据样品选择合理的线性范围，增加标准溶液配制过程的移取体积和定容体积以减少标准溶液引入的不确定度，同时也要提高检测人员试验水平、试验回收率以及检测结果的准确性。 参考文献
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