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克隆血小板/T细胞活化抗原1(platelet and T cell activation antigen 1,PTA1)胞膜外区基因片段,构建、表达、纯化PTA1胞膜外区与IgG Fc融合蛋白,用于PTA1配体鉴定的研究。
方法针对人PTA1 cDNA设计引物,通过反转录、半套式PCR从TPA活化的Jurkat细胞中扩增PTA1胞膜外区基因片段,并进行序列测定,而后将其进一步克隆入融合蛋白表达载体pIG中,构建重组表达载体pPTA1/Ig,经DEAE-Dextran法转染COS-7细胞后通过亲和层析纯化,融合蛋白经SDS-PAGE、夹心ELISA及Western blot鉴定。
结果获得793bp PTA1胞膜外区基因片段,构建成功PTA1/Ig融合蛋白表达载体,制备了可用于纯化PTA1/Ig的亲和层析柱,建立了检测融合蛋白的夹心ELISA方法。经SDS-PAGE、夹心ELISA及Western blot证实融合蛋白在COS-7细胞中获得表达,相对分子质量为83×103,表达效率约为1.3mg/L。
结论PTA1/Ig融合表达载体构建及表达成功,获得的融合蛋白可以模拟天然的PTA1分子,为PTA1配体的鉴定提供了有力的工具。