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摘要：通过DNA条形码技术，以psbA-trnH基因为条形码编码序列对枸杞属植物21份试验材料进行鉴定分析，在分子水平上获得鉴定枸杞属植物的理论依据。采用Clustal X比对序列，用Mega 7.0计算遗传变异距离并比较序列间的差异，基于K2P模型构建系统发育树。结果表明，psbA-trnH序列的遗传距离范围为0.000 0～0.009 2，平均遗传距离为0.003 0，可以鉴别亲缘关系较远的枸杞属品种，并且构建的系统发育树将航天诱变种与普通栽培种分成了2大支，各分支内部均具有较高的自展支持率，因此，psbA-trnH序列可以作为初步鉴定枸杞属植物的DNA条形码。
关键词：枸杞属;DNA条形码;分子鉴定
中图分类号： S567.1 90.24 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）01-0056-04
枸杞为茄科（Solanaceae）茄族（Solaneae Reichb.）枸杞亚族（Lyciinae Wettst）枸杞属（Lycium L.）植物，是多年生落叶灌木[1]，其果实、根皮、叶均具有较高的药用及保健价值。该属约有80种，是一个世界分布属[2]，国内主要种植区域分布在宁夏、新疆、甘肃、青海等地[3]。由于各品种间常有相同的基原或近缘，其发育形态、组织结构及所含的化学成分具有高度的相似性[4]，因此传统的形态学鉴别方法已难以解决此问题。
DNA条形码（DNA barcoding）是利用1个或少数几个DNA片段对目标物种进行识别和鉴定的一项新技术[5]，它具有操作简便、准确性高、鉴定快速等特点[6]，已成为现代生物分类学研究中引人关注的新方向和研究热点。近些年来，国内外学者对适合用于鉴定植物的DNA条形码基因序列进行了积极的探索与研究，发现psbA-trnH基因片段进化速率快，能够积累较多变异，从而能够鉴别亲缘关系很近的物种[7-10]，因此适宜作为鉴定植物的DNA条形码。
本研究旨在对21份枸杞属植物试验材料进行psbA-trnH的序列测定，并通过序列比对、序列间差异分析及构建系统发育树，探索其在枸杞属植物中的适用性，从而为物种鉴定和分类提供依据并奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
采样时间：2017年6月14日。采样地点：宁夏银川市（芦花台）枸杞国家林木种质资源库，地处银川平原西部、贺兰山东麓，地理位置为105°49′～106°18′E，38°08′～38°52′N，年平均蒸发量为1 583.2 mm，年平均太阳辐射量为 146 kcal/cm2，全年平均日照时数超过 3 000 h，日照率为69%，光能资源丰富，年平均气温差为 32 ℃ 左右，无霜期较短，降水量较少，属于中温带干旱型气候。
采样品种：在银川市枸杞国家林木种质资源库采集21份枸杞属植物新鲜叶片于5 mL冻存管中，保存于液氮中备用。样品详情见表1。
1.2 试验方法
2017年6月19日至7月21日在宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所功能基因分析实验室进行21份枸杞属植物材料的基因提取及克隆工作。具体工作流程如下：
总DNA的提取：采用新型植物基因组DNA提取试剂盒（DNA secure Plant Kit）提取DNA。
PCR扩增。设计如下引物：P1，5′-GTTATGCATGAACG TAATGCTC-3′;P2，5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′，用以上引物对21个试验材料在Bio-Rad PCR仪上进行PCR扩增，扩增体系（15 μL）：2×pfumix（pfumix指浓缩PCR扩增预混合溶液）7.5 μL，P1和P2各0.5 μL，模板DNA 2 μL，最后加ddH2O 4.5 μL补足至 15 μL。反应程序：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，36个循环;72 ℃保温10 min。将PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳。
切胶回收：采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒对目标条带进行回收，并用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行回收检测，将纯化后的目标DNA作为测序反应的模板。
连接转化：采用pLB零背景快速克隆试剂盒，将回收产物连接于T载体（pGEM-T），再转入大肠杆菌进行培养。
阳性克隆的筛选及测序：采用蓝白斑法筛选阳性克隆，并进行菌落PCR及电泳检测。最后送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.3 序列统计分析方法
利用Clustal X进行序列比对，用Mega 7.0计算目标序列的碱基组成、序列间的碱基变异频率和序列间的转换颠换频率及其比率。通过比较序列种内和种间差异的分布，利用Mega 7.0构建系统发育树，评价各序列的鉴定效果。
2 结果与分析
2.1 序列测定结果
测得21份枸杞属植物叶绿体psbA-trnH间隔序列共21条，在美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站上进行BLAST相似性检索，均有较好的匹配程度，确认为目标序列，检索比对结果表明测序结果可靠准确。
2.2 序列信息分析
利用Mega 7.0软件对目标序列进行分析，结果显示，21份枸杞属植物材料的psbA-trnH间隔序列的长度均在546～565 bp之间，其中，北方枸杞和河北枸杞的psbA-trnH序列最长，达到565 bp，其次是黄果变、黑果枸杞、宁农杞5号、昌吉枸杞及6个航天诱变种，长度均为555 bp，宁杞1号至宁杞7号，宁农杞9号及圆果枸杞序列长度最短，为546 bp。21份枸杞属植物材料的G C含量也存在差异，变异范围為30.3%～31.4%。为使试验结果更加清晰，加入外类群的分析，在NCBI上进行枸杞属植物psbA-trnH间隔序列的BLAST检索，找到外类群美国枸杞的序列信息，长度为 513 bp，G C含量为29.9%（表2）。 2.3 序列比对分析
经过序列比对，发现21条序列之间不仅发生了转换和颠换，而且存在碱基或片段缺失现象。除了北方枸杞与河北枸杞，其他19种枸杞属植物均在185 bp处存在19个碱基的缺失，与7个航天诱变种、黑果枸杞、黄果变以及昌吉枸杞相比，其他11种枸杞均在496 bp处存在9个碱基的缺失。利用Mega 7.0软件计算表明，在21种枸杞属植物的psbA-trnH序列中，保守位点（C）为566个，变异位点（V）数量为8个，其中简约位点（Pi）4个，自裔位点（S）4个，其转换/颠换值（R）为0.2。
2.4 遗传距离分析
在21份试验材料psbA-trnH序列比对的基础上，借助Mega 7.0计算Kimura 2-parameter遗传距离。结果表明，21种枸杞的遗传距离为0.000 0～0.009 2 cM，其中遗传距离最小（0.000 0 cM）的组合有4个，分别是河北枸杞与北方枸杞和圆果枸杞、黄果变与黑果枸杞、宁杞1号至宁杞7号与宁农杞9号、7个航天诱变种，其亲缘关系最为接近，而昌吉枸杞与北方枸杞、圆果枸杞、河北枸杞之间的遗传距离最大（0.009 2 cM），亲缘关系最远，它们的平均遗传距离为 0.003 0 cM（表3）。
2.5 枸杞属MP树鉴定
根据21个枸杞品种的序列测定结果，采用最大简约数法（maximum parasimony，简称MP）构建MP系统发育树，模型为Kimura 2-parameter，拓扑结构的可靠性用1 000次重复的自展检测（bootstrap analysis）来评估（图1）。psbA-trnH条形码序列的聚类图分成了2大支，宁杞1号到宁杞7号、宁农杞9号、圆果枸杞、北方枸杞、河北枸杞及外类群美国种聚为1大支，其中宁杞1号至7号与宁农杞9号处于同一分支，亲缘关系最近，圆果枸杞、北方枸杞与河北枸杞为同一支，亲缘关系最近，外类群美国品种单独为1支，与上述11个品种的亲缘关系最远。航天诱变种与黄果变、黑果枸杞和昌吉枸杞聚为1大支，与其他品种亲缘关系较远，其中7个航天诱变种聚为同一支，亲缘关系最近，黄果变、黑果枸杞、昌吉枸杞聚为同一支，与上述7个品种的亲缘关系较远。
3 结论与讨论
由于枸杞属种质资源较为丰富，起源驯化有多种途径，栽培历史悠久，属内种间杂交现象普遍[11]，且诸多地方品种无科学命名，导致品种资源类型多且名称乱，因此鉴定评价枸杞属种质资源具有深刻的意义[12]。本研究中21份种质材料属于枸杞属近缘种，在遗传多样性鉴定评价过程中，农艺性状易受环境和栽培技术的影响不易鉴别，细胞学性状多态性不丰富，此外同工酶性状有器官特异性且受生长发育阶段的影响，具有一定的局限性[13]。而分子标记法的出现，为资源鉴定评价提供了新的方法[14-15]。本研究利用叶绿体间隔序列 psbA-trnH 的保守区设计引物，扩增出完整序列片段，并对扩增产物进行序列测定。经分析得出21份枸杞属种质资源的psbA-trnH序列长度范围为546～565 bp，共有8个变异位点，虽然序列过于保守，但其系统发育树将21份种质材料分成2大类，普通栽培种与圆果枸杞、北方枸杞、河北枸杞聚成1支，航天诱变种与黑果枸杞、黄果变、昌吉枸杞聚为1支，且各分支内部具有较高的自展支持率，表明依据psbA-trnH序列的差异可以鉴定亲缘关系较远的枸杞属种质，而亲缘关系较近的种质资源还需进一步研究。
参考文献：
[1]袁宝财，达海莉，李晓瑞. 宁夏枸杞的生物学特性及开发利用前景[J]. 河北林果研究，2001，16（2）：151-153.
[2]石志刚，杜慧莹，门惠芹. 枸杞种质资源描述规范和数据标准[M]. 北京：中国林业出版社，2012.
[3]苏宇静，贺海明，孙兆军. 中国枸杞资源及其在食品工業中的应用现状和开发前景[J]. 食品科学，2002，23（8）：292-294.
[4]石志刚，万 如，李彦龙，等. 宁夏枸杞主要品种psbA-trntH的DNA条形码鉴定的初步研究[J]. 农业科技与装备，2016（6）：1-2，7.
[5]于 杰，闫化学，鲁振华，等. 基于matK和rbcL DNA序列条形码鉴定橘柑及其近缘属植物[J]. 园艺学报，2011，38（9）：1733-1740.
[6]Stoeckle M，Waggoner P，Ausubel J. Barcoding life：ten reasons.identifying species by DNA[J]. Consortium for the Barcode of Life，2004：1-2.
[7]陈士林，姚 辉，宋经元，等. 基于DNA barcoding（条形码）技术的中药材鉴定[J]. 世界科学技术-中医药现代化，2007，9（3）：7-12.
[8]陈士林. 中药DNA条形码分子鉴定[M]. 北京：人民卫生出版社，2012.
[9]宁淑萍，颜海飞，郝 刚，等. 植物DNA条形码研究进展[J]. 生物多样性，2008，16（5）：417-425.
[10]刘宇婧，刘 越，黄耀江，等. 植物DNA条形码技术的发展及应用[J]. 植物资源与环境学报，2011，20（1）：74-82，93.
[11]石志刚，马婷慧，万 如，等. 基于ITS条形码序列早期筛选枸杞种内杂交种[J]. 江苏农业科学，2017，45（6）：138-139.
[12]李小刚，王有科，李 捷，等. 基于nrDNA-ITS序列的10种枸杞属植物亲缘关系研究[J]. 中国农学通报，2014，30（25）：128-135.
[13]石志刚，万 如，李彦龙，等. 基于ITS条形码序列的枸杞属植物鉴定[J]. 湖北农业科学，2016，55（22）：5966-5968.
[14]任 海，吕小红，杜 萌. 多抗水稻分子标记辅助育种方法[J]. 江苏农业科学，2017，45（19）：154-158.
[15]李 红，张 敏，肖千明，等. 基于ISSR-PCR分子标记的滑菇遗传多样性分析[J]. 江苏农业科学，2017，45（6）：39-41.王红崧，毕振佳，王云月，等. 哈尼梯田传统稻种遗传多样性影响因素[J]. 江苏农业科学，2019，47（1）：60-66.
关键词：枸杞属;DNA条形码;分子鉴定
中图分类号： S567.1 90.24 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）01-0056-04
枸杞为茄科（Solanaceae）茄族（Solaneae Reichb.）枸杞亚族（Lyciinae Wettst）枸杞属（Lycium L.）植物，是多年生落叶灌木[1]，其果实、根皮、叶均具有较高的药用及保健价值。该属约有80种，是一个世界分布属[2]，国内主要种植区域分布在宁夏、新疆、甘肃、青海等地[3]。由于各品种间常有相同的基原或近缘，其发育形态、组织结构及所含的化学成分具有高度的相似性[4]，因此传统的形态学鉴别方法已难以解决此问题。
DNA条形码（DNA barcoding）是利用1个或少数几个DNA片段对目标物种进行识别和鉴定的一项新技术[5]，它具有操作简便、准确性高、鉴定快速等特点[6]，已成为现代生物分类学研究中引人关注的新方向和研究热点。近些年来，国内外学者对适合用于鉴定植物的DNA条形码基因序列进行了积极的探索与研究，发现psbA-trnH基因片段进化速率快，能够积累较多变异，从而能够鉴别亲缘关系很近的物种[7-10]，因此适宜作为鉴定植物的DNA条形码。
本研究旨在对21份枸杞属植物试验材料进行psbA-trnH的序列测定，并通过序列比对、序列间差异分析及构建系统发育树，探索其在枸杞属植物中的适用性，从而为物种鉴定和分类提供依据并奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
采样时间：2017年6月14日。采样地点：宁夏银川市（芦花台）枸杞国家林木种质资源库，地处银川平原西部、贺兰山东麓，地理位置为105°49′～106°18′E，38°08′～38°52′N，年平均蒸发量为1 583.2 mm，年平均太阳辐射量为 146 kcal/cm2，全年平均日照时数超过 3 000 h，日照率为69%，光能资源丰富，年平均气温差为 32 ℃ 左右，无霜期较短，降水量较少，属于中温带干旱型气候。
采样品种：在银川市枸杞国家林木种质资源库采集21份枸杞属植物新鲜叶片于5 mL冻存管中，保存于液氮中备用。样品详情见表1。
1.2 试验方法
2017年6月19日至7月21日在宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所功能基因分析实验室进行21份枸杞属植物材料的基因提取及克隆工作。具体工作流程如下：
总DNA的提取：采用新型植物基因组DNA提取试剂盒（DNA secure Plant Kit）提取DNA。
PCR扩增。设计如下引物：P1，5′-GTTATGCATGAACG TAATGCTC-3′;P2，5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′，用以上引物对21个试验材料在Bio-Rad PCR仪上进行PCR扩增，扩增体系（15 μL）：2×pfumix（pfumix指浓缩PCR扩增预混合溶液）7.5 μL，P1和P2各0.5 μL，模板DNA 2 μL，最后加ddH2O 4.5 μL补足至 15 μL。反应程序：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，36个循环;72 ℃保温10 min。将PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳。
切胶回收：采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒对目标条带进行回收，并用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行回收检测，将纯化后的目标DNA作为测序反应的模板。
连接转化：采用pLB零背景快速克隆试剂盒，将回收产物连接于T载体（pGEM-T），再转入大肠杆菌进行培养。
阳性克隆的筛选及测序：采用蓝白斑法筛选阳性克隆，并进行菌落PCR及电泳检测。最后送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.3 序列统计分析方法
利用Clustal X进行序列比对，用Mega 7.0计算目标序列的碱基组成、序列间的碱基变异频率和序列间的转换颠换频率及其比率。通过比较序列种内和种间差异的分布，利用Mega 7.0构建系统发育树，评价各序列的鉴定效果。
2 结果与分析
2.1 序列测定结果
测得21份枸杞属植物叶绿体psbA-trnH间隔序列共21条，在美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站上进行BLAST相似性检索，均有较好的匹配程度，确认为目标序列，检索比对结果表明测序结果可靠准确。
2.2 序列信息分析
利用Mega 7.0软件对目标序列进行分析，结果显示，21份枸杞属植物材料的psbA-trnH间隔序列的长度均在546～565 bp之间，其中，北方枸杞和河北枸杞的psbA-trnH序列最长，达到565 bp，其次是黄果变、黑果枸杞、宁农杞5号、昌吉枸杞及6个航天诱变种，长度均为555 bp，宁杞1号至宁杞7号，宁农杞9号及圆果枸杞序列长度最短，为546 bp。21份枸杞属植物材料的G C含量也存在差异，变异范围為30.3%～31.4%。为使试验结果更加清晰，加入外类群的分析，在NCBI上进行枸杞属植物psbA-trnH间隔序列的BLAST检索，找到外类群美国枸杞的序列信息，长度为 513 bp，G C含量为29.9%（表2）。 2.3 序列比对分析
经过序列比对，发现21条序列之间不仅发生了转换和颠换，而且存在碱基或片段缺失现象。除了北方枸杞与河北枸杞，其他19种枸杞属植物均在185 bp处存在19个碱基的缺失，与7个航天诱变种、黑果枸杞、黄果变以及昌吉枸杞相比，其他11种枸杞均在496 bp处存在9个碱基的缺失。利用Mega 7.0软件计算表明，在21种枸杞属植物的psbA-trnH序列中，保守位点（C）为566个，变异位点（V）数量为8个，其中简约位点（Pi）4个，自裔位点（S）4个，其转换/颠换值（R）为0.2。
2.4 遗传距离分析
在21份试验材料psbA-trnH序列比对的基础上，借助Mega 7.0计算Kimura 2-parameter遗传距离。结果表明，21种枸杞的遗传距离为0.000 0～0.009 2 cM，其中遗传距离最小（0.000 0 cM）的组合有4个，分别是河北枸杞与北方枸杞和圆果枸杞、黄果变与黑果枸杞、宁杞1号至宁杞7号与宁农杞9号、7个航天诱变种，其亲缘关系最为接近，而昌吉枸杞与北方枸杞、圆果枸杞、河北枸杞之间的遗传距离最大（0.009 2 cM），亲缘关系最远，它们的平均遗传距离为 0.003 0 cM（表3）。
2.5 枸杞属MP树鉴定
根据21个枸杞品种的序列测定结果，采用最大简约数法（maximum parasimony，简称MP）构建MP系统发育树，模型为Kimura 2-parameter，拓扑结构的可靠性用1 000次重复的自展检测（bootstrap analysis）来评估（图1）。psbA-trnH条形码序列的聚类图分成了2大支，宁杞1号到宁杞7号、宁农杞9号、圆果枸杞、北方枸杞、河北枸杞及外类群美国种聚为1大支，其中宁杞1号至7号与宁农杞9号处于同一分支，亲缘关系最近，圆果枸杞、北方枸杞与河北枸杞为同一支，亲缘关系最近，外类群美国品种单独为1支，与上述11个品种的亲缘关系最远。航天诱变种与黄果变、黑果枸杞和昌吉枸杞聚为1大支，与其他品种亲缘关系较远，其中7个航天诱变种聚为同一支，亲缘关系最近，黄果变、黑果枸杞、昌吉枸杞聚为同一支，与上述7个品种的亲缘关系较远。
3 结论与讨论
由于枸杞属种质资源较为丰富，起源驯化有多种途径，栽培历史悠久，属内种间杂交现象普遍[11]，且诸多地方品种无科学命名，导致品种资源类型多且名称乱，因此鉴定评价枸杞属种质资源具有深刻的意义[12]。本研究中21份种质材料属于枸杞属近缘种，在遗传多样性鉴定评价过程中，农艺性状易受环境和栽培技术的影响不易鉴别，细胞学性状多态性不丰富，此外同工酶性状有器官特异性且受生长发育阶段的影响，具有一定的局限性[13]。而分子标记法的出现，为资源鉴定评价提供了新的方法[14-15]。本研究利用叶绿体间隔序列 psbA-trnH 的保守区设计引物，扩增出完整序列片段，并对扩增产物进行序列测定。经分析得出21份枸杞属种质资源的psbA-trnH序列长度范围为546～565 bp，共有8个变异位点，虽然序列过于保守，但其系统发育树将21份种质材料分成2大类，普通栽培种与圆果枸杞、北方枸杞、河北枸杞聚成1支，航天诱变种与黑果枸杞、黄果变、昌吉枸杞聚为1支，且各分支内部具有较高的自展支持率，表明依据psbA-trnH序列的差异可以鉴定亲缘关系较远的枸杞属种质，而亲缘关系较近的种质资源还需进一步研究。
参考文献：
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[8]陈士林. 中药DNA条形码分子鉴定[M]. 北京：人民卫生出版社，2012.
[9]宁淑萍，颜海飞，郝 刚，等. 植物DNA条形码研究进展[J]. 生物多样性，2008，16（5）：417-425.
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[13]石志刚，万 如，李彦龙，等. 基于ITS条形码序列的枸杞属植物鉴定[J]. 湖北农业科学，2016，55（22）：5966-5968.
[14]任 海，吕小红，杜 萌. 多抗水稻分子标记辅助育种方法[J]. 江苏农业科学，2017，45（19）：154-158.
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