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摘要：目的：考察银离子伤口敷料的细菌内毒素检查方法的可行性。方法：依据《中华人民共和国药典》2010年版附录XIE细菌内毒素检查法，确定银离子伤口敷料的有效的稀释浓度和细菌内毒素限值。结果：银离子伤口敷料的浸提液在稀释2倍后对细菌内毒素试验无干扰作用，其细菌内毒素限值符合规定。结论：该产品可以采用细菌内毒素检查法。
关键词：细菌内毒素；干扰试验；鲎试剂；银离子敷料
中图分类号：Q939文献标识码： A
作为评价医用生物材料生物学安全性指标之一的细菌内毒素试验是检测其是否含有引起机体发热的内毒素的方法。目的是利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判定样品中细菌内毒素的限量是否符合规定。本文参照《中华人民共和国药2010年版二部》附录ⅪE细菌内毒素检查法，来确定银离子伤口敷料的细菌内毒素检查方法的可行性。
1 材料与仪器
1.1 试剂
鲎试剂
规格：0.1mL/支，批号：1305312，灵敏度：0.25EU/mL，湛江安度斯生物有限公司。
规格：0.1mL/支，批号：1306160，灵敏度：0.25EU/mL，湛江博康海洋生物有限公司。
细菌内毒素工作标准品
规格：120EU/支，批号：150601-201175，中国食品药品检定研究院。
细菌内毒素检查用水（BET水）
规格：100mL/支，批号：1301120，湛江安度斯生物有限公司。
1.2 样品
银离子伤口敷料 规格：10cm×10cm，批号：D0490016，国内某公司生产。
1.3 仪器
隔水培养箱，规格型号：GH6000，生产单位：天津市泰斯特仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱，规格型号：DHG-9143BS-III，生产单位：上海新苗医疗器械制造有限公司；漩涡振荡器，规格型号：ZH-2，生产单位：天津药典标准仪器厂；细菌内毒素凝胶法测定仪，规格型号：ET-96，生产单位：天津市天大天发科技有限公司。
2 方法
2.1 试验准备
实验所用器材，经180℃烘烤3 h以上除去可能存在的外源内毒素。
2.2 鲎试剂灵敏度的复核
按《中华人民共和国药典》2010年版附录XIE细菌内毒素检查法复核鲎试剂灵敏度[1]，结果见表1。所用两个厂家的鲎试剂标示灵敏度λ为0.25 EU/mL。
表1 灵敏度复核结果
2批鲎试剂的λc均在0.5λ~2.0λ之间, 表明2批鲎试剂灵敏度均符合规定, 可用于细菌内毒素检查, 并以λ作为该批鲎试剂的灵敏度。
2.3 样品供试液的制备[2]
取银离子伤口敷料护创垫120cm2，置于一个无热原的玻璃烧杯中，吸饱和后加入40mLBET水，浸没样品，在37℃±1℃下浸提2小时。
2.4 干扰试验
2.4.1样品的最大有效稀释倍数
查阅医用敷料的相关文献将该样品限值定为0.5EU/mL[3]。目前市售鲎试剂灵敏度一般在0.03~0.50EU/mL。所以供试品在对应不同灵敏度鲎试剂时的最大有效稀释倍数分别为2、4、8、16倍。
2.4.2干扰预试验[4]
将供试液用BET水稀释成2、4、8、16倍的系列稀释溶液。用系列稀释溶液加入细菌内毒素标准溶液，使不同稀释倍数溶液中均含有2λ浓度的内毒素。用2个厂家灵敏度为0.25EU/mL的鲎试剂进行试验（结果见表2），同时做阳性和阴性对照。
表2 干扰预实验结果
结果表明，样品在2倍稀释后有可能排除干扰。
2.4.3正式干扰试验
按《中华人民共和国药典》2010年版附录XIE进行正式干扰试验[4,5]，分别用BET水及供试液2倍稀释液将细菌内毒素工作标准品配制成浓度为 0.5、0.25、0.125、0.06EU/mL的溶液，同时用BET水和供试液2倍稀释液各做两管阴性对照，用两个厂家灵敏度均为0.25EU/mL的鲎试剂进行试验（结果见表3）。
表3 正式干扰试验的结果
结果表明，Es均在0.5λ~2.0λ之间，Et均在0.5Es~2.0Es之间，说明供试液2倍稀释液对细菌内毒素试验无干扰作用，该样品可以采用细菌内毒素检查法进行检测。
2.5 样品检测
取供试液2倍稀释液，用灵敏度为0.25EU/mL的鲎试剂按中国药典进行细菌内毒素检查（结果见表 4）。结果表明，该样品的细菌内毒素检查是符合规定的。即样品中的细菌内毒素含量小于0.5EU/mL。
表4 银离子伤口敷料的细菌内毒素检查结果
3 讨论
试验结果表明，银离子伤口敷料的细菌内毒素含量小于0.5EU/mL。由于细菌内毒素检查法具有操作简单、灵敏度高、重现性好的优点，故可以用本方法来检查银离子伤口敷料的细菌内毒素含量, 以达到安全用械的目的。
参考文献
[1] 國家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版二部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：99-102.
[2] GB/T16886.12-2005，医疗器械生物学评价第12 部分：样品制备与参照样品[S].北京：中国标准出版社，2005.
[3] 陈丹丹，杜晓丹，李彦红，韩倩倩.纳米银抗菌医用敷料的细菌内毒素检测[A]. 第十四届中国科协年会第17分会场：环境危害与健康防护研讨会论文集[C].2012
[4] 陈丹丹，付海洋，付步芳.纳米银妇女外用抗菌凝胶的细菌内毒素检测[J].生物医学工程与临床，2010，14（4）：282-284.
[5] 林玲，潘雯，关倩明.注射用两性霉素 B脂质体细菌内毒素检查法研究[J].广东药学院学报，2011，27（3）：274-276.
*通讯作者：高静贤，女，工程师，江苏省医疗器械检验所生物安全评价中心主任。
关键词：细菌内毒素；干扰试验；鲎试剂；银离子敷料
中图分类号：Q939文献标识码： A
作为评价医用生物材料生物学安全性指标之一的细菌内毒素试验是检测其是否含有引起机体发热的内毒素的方法。目的是利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判定样品中细菌内毒素的限量是否符合规定。本文参照《中华人民共和国药2010年版二部》附录ⅪE细菌内毒素检查法，来确定银离子伤口敷料的细菌内毒素检查方法的可行性。
1 材料与仪器
1.1 试剂
鲎试剂
规格：0.1mL/支，批号：1305312，灵敏度：0.25EU/mL，湛江安度斯生物有限公司。
规格：0.1mL/支，批号：1306160，灵敏度：0.25EU/mL，湛江博康海洋生物有限公司。
细菌内毒素工作标准品
规格：120EU/支，批号：150601-201175，中国食品药品检定研究院。
细菌内毒素检查用水（BET水）
规格：100mL/支，批号：1301120，湛江安度斯生物有限公司。
1.2 样品
银离子伤口敷料 规格：10cm×10cm，批号：D0490016，国内某公司生产。
1.3 仪器
隔水培养箱，规格型号：GH6000，生产单位：天津市泰斯特仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱，规格型号：DHG-9143BS-III，生产单位：上海新苗医疗器械制造有限公司；漩涡振荡器，规格型号：ZH-2，生产单位：天津药典标准仪器厂；细菌内毒素凝胶法测定仪，规格型号：ET-96，生产单位：天津市天大天发科技有限公司。
2 方法
2.1 试验准备
实验所用器材，经180℃烘烤3 h以上除去可能存在的外源内毒素。
2.2 鲎试剂灵敏度的复核
按《中华人民共和国药典》2010年版附录XIE细菌内毒素检查法复核鲎试剂灵敏度[1]，结果见表1。所用两个厂家的鲎试剂标示灵敏度λ为0.25 EU/mL。
表1 灵敏度复核结果
2批鲎试剂的λc均在0.5λ~2.0λ之间, 表明2批鲎试剂灵敏度均符合规定, 可用于细菌内毒素检查, 并以λ作为该批鲎试剂的灵敏度。
2.3 样品供试液的制备[2]
取银离子伤口敷料护创垫120cm2，置于一个无热原的玻璃烧杯中，吸饱和后加入40mLBET水，浸没样品，在37℃±1℃下浸提2小时。
2.4 干扰试验
2.4.1样品的最大有效稀释倍数
查阅医用敷料的相关文献将该样品限值定为0.5EU/mL[3]。目前市售鲎试剂灵敏度一般在0.03~0.50EU/mL。所以供试品在对应不同灵敏度鲎试剂时的最大有效稀释倍数分别为2、4、8、16倍。
2.4.2干扰预试验[4]
将供试液用BET水稀释成2、4、8、16倍的系列稀释溶液。用系列稀释溶液加入细菌内毒素标准溶液，使不同稀释倍数溶液中均含有2λ浓度的内毒素。用2个厂家灵敏度为0.25EU/mL的鲎试剂进行试验（结果见表2），同时做阳性和阴性对照。
表2 干扰预实验结果
结果表明，样品在2倍稀释后有可能排除干扰。
2.4.3正式干扰试验
按《中华人民共和国药典》2010年版附录XIE进行正式干扰试验[4,5]，分别用BET水及供试液2倍稀释液将细菌内毒素工作标准品配制成浓度为 0.5、0.25、0.125、0.06EU/mL的溶液，同时用BET水和供试液2倍稀释液各做两管阴性对照，用两个厂家灵敏度均为0.25EU/mL的鲎试剂进行试验（结果见表3）。
表3 正式干扰试验的结果
结果表明，Es均在0.5λ~2.0λ之间，Et均在0.5Es~2.0Es之间，说明供试液2倍稀释液对细菌内毒素试验无干扰作用，该样品可以采用细菌内毒素检查法进行检测。
2.5 样品检测
取供试液2倍稀释液，用灵敏度为0.25EU/mL的鲎试剂按中国药典进行细菌内毒素检查（结果见表 4）。结果表明，该样品的细菌内毒素检查是符合规定的。即样品中的细菌内毒素含量小于0.5EU/mL。
表4 银离子伤口敷料的细菌内毒素检查结果
3 讨论
试验结果表明，银离子伤口敷料的细菌内毒素含量小于0.5EU/mL。由于细菌内毒素检查法具有操作简单、灵敏度高、重现性好的优点，故可以用本方法来检查银离子伤口敷料的细菌内毒素含量, 以达到安全用械的目的。
参考文献
[1] 國家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版二部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：99-102.
[2] GB/T16886.12-2005，医疗器械生物学评价第12 部分：样品制备与参照样品[S].北京：中国标准出版社，2005.
[3] 陈丹丹，杜晓丹，李彦红，韩倩倩.纳米银抗菌医用敷料的细菌内毒素检测[A]. 第十四届中国科协年会第17分会场：环境危害与健康防护研讨会论文集[C].2012
[4] 陈丹丹，付海洋，付步芳.纳米银妇女外用抗菌凝胶的细菌内毒素检测[J].生物医学工程与临床，2010，14（4）：282-284.
[5] 林玲，潘雯，关倩明.注射用两性霉素 B脂质体细菌内毒素检查法研究[J].广东药学院学报，2011，27（3）：274-276.
*通讯作者：高静贤，女，工程师，江苏省医疗器械检验所生物安全评价中心主任。