为建立一种简便、快速、特异、可定量检测样品中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE抗原的时间分辨荧光微球免疫层析检测方法,采用单克隆抗体技术和荧光微球免疫层析技术,以羧基荧光微球和NC膜为载体将单克隆抗体进行标记和包被,制备PRV gE抗原检测试纸卡.优化了标记抗体、包被抗体的工艺,并通过试纸卡线性范围、最低检出限、特异性等性能指标对其进行评价.最终确定20 μL荧光微球的标记抗体量为20 μg,检测线包被抗体质量浓度为2 g/L时,检测时间为15 min,线性范围为1:6.25～1:200.00倍稀释的TCID50为1×108.6/0.1 mL的PRV抗原,最低检出限为1:800倍稀释的TCID50为1×108.6/0.1 mL的PRV抗原,精密性小于10％,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及PRV Batha-K61株、PRV-HB2000株等均无交叉反应,室温干燥条件下至少保存10个月.该试纸卡与PRV gE与gD二重实时荧光PCR平行检测134份临床样本,两者总符合率为89.55％.初步建立了定量检测样品中PRVgE抗原时间分辨荧光免疫层析检测方法,有良好的临床应用价值.