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【摘要】目的 探讨银杏叶提取物（GBE）对戊四氮（PTZ）慢性致痫大鼠模型癫痫发作的影响及脑保护作用。方法 健康成年雄性SD大鼠40只，随机分为4组：PTZ致痫组、PTZ+丙戊酸（VPA）组、PTZ+VPA+ GBE组、生理盐水（NS）对照组，每组10只，观察各组大鼠的行为学、脑电图（EEG）、电迷宫正确率和颞叶海马T型Ca2+通道Cav3.2表达变化。结果PTZ+VPA 组、PTZ+VPA+GBE组和NS组发作级别为0-Ⅱ级，EEG正常或少量棘慢波，EEG总功率差值及颞叶海马Cav3.2水平较PTZ组显著降低，差别有统计学意义（P＜0.05）；相比于PTZ+VPA 组，PTZ+VPA+GBE组颞叶海马Cav3.2表达明显减少，差别有统计学意义（P＜0.05）。结论 GBE能降低Cav3.2水平，显著降低癫痫大鼠发作级别、减少脑部异常放电和改善认知功能，有辅助抗癫痫和脑保护作用。
【关键词】戊四氮（PTZ）；银杏叶提取物（GBE）；丙戊酸（VPA）；脑电图（EEG）；电迷宫
癫痫是由大脑神经元突然过度异常放电所致的反复短暂中枢神经系统功能失常为特征的慢性疾病，严重危害人类健康。其发病机制复杂，治疗靶点多样。当前的研究趋势之一是寻找具有神经保护作用的新型抗癫痫药。近年来，具有明显神经保护作用的银杏叶提取物(GBE)广泛用于心脑血管疾病的防治，仅少量涉及GBE对癫痫的干预。本实验用GBE、VPA干预戊四氮致痫大鼠，通过对其癫痫发作、认知功能和T型Ca2+通道蛋白Cav3.2表达的观察，探究GBE对癫痫发作的影响及发作后脑损伤的保护作用。
1材料和方法
1.1试剂和仪器 PTZ、Anti-Calcium Channel Cav3.2 (a1H)（Sigma公司），兔SP检测试剂盒SP-9001（北京中杉金桥生物技术有限公司），GBE（法国博福—益普生制药工业公司，含24%黄酮糖苷，6%萜类，其中银杏苦内酯占3.1%，白果内酯(又称银杏内酯)占2.9%），日本光电4371F脑电图机，MG-20/3C 迷宫刺激器（张家港市生物医学仪器厂），德国Lecia显微照像系统，Biosens Digital Imaging Systemv1.6分析系统。
1.2动物分组及模型制作成年雄性SD大鼠40只，体重250g左右，河南省实验动物中心提供，按随机数字表法分为4组，每组10只。PTZ致痫组、PTZ+丙戊酸（VPA）組、PTZ+VPA+ GBE组、生理盐水（NS）对照组，分别标记为A组、B组、C组、D组。A-C组按照Diehl[5]的方法制作大鼠点燃模型，即按35mg/kg腹腔注射（ip）10g/L PTZ生理盐水溶液，每日一次；B组在ip PTZ之前1小时给予丙戊酸80mg/kg[2]灌胃（ig）；C组在ip PTZ之前1.5小时给予银杏叶提取物100mg/kg[3] ，ip PTZ之前1小时给予丙戊酸80mg/kg ig；D组按3.5ml/kg腹腔注射生理盐水，每日一次。各组于每天下午3点开始用药，实验周期为8周，其中C组在腹腔注射PTZ之前的3天只给予GBE。
1.3观察方法
1.3.1 大鼠行为学评估指标根据Racine分级法观察痫性发作级别：0 级：无抽搐发作；Ⅰ级：面部痉挛；Ⅱ级：面部痉挛+节律性点头；Ⅲ级：面部痉挛+节律性点头+前肢阵挛；Ⅳ级：面部痉挛+节律性点头+前肢阵挛+后肢站立；Ⅴ级：面部痉挛+节律性点头+前肢阵挛+后肢站立+跌倒；连续3天出现Ⅳ级发作或达到Ⅴ级发作判定为完全点燃。观察并记录大鼠腹腔注射PTZ或生理盐水后1小时内，每只大鼠的行为学变化。
1.3.2 脑电图描记第八周末对40只实验大鼠进行EEG描记。方法为：用粗棉线套住大鼠4只脚固定于木板上，将3根特制针电极分别插入大鼠前额、左右颞叶部位头皮下，使三个插入点成为等腰三角形状，其中顶角为参考电极，用胶带固定电极和电线。
1.3.3 Y型电迷宫正确率测定第8周，对40只SD大鼠进行电迷宫测试。Y型电迷宫，又称三等分辐射式迷路箱,设置电压50-100V，延迟时间5秒。实验开始时，不通电，随机选择一臂作为起步区，将大鼠置于起步区，由于好奇心大鼠在三臂中探索3-5分钟，待大鼠稳定后将其放回起步区。选择起步区所之外任一区作为安全区，按下其对应的按键，安全区灯亮后5秒时，电刺激开始，大鼠最终逃到亮灯的安全区，30秒后熄灯，一次测试结束。
1.3.4 免疫组化染色在描记EEG后，各组大鼠10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔麻醉，10%甲醛全身灌注固定，然后断头取脑，将大脑置于10%甲醛中室温固定36小时，常规石蜡包埋。用切片机连续冠状切取颞叶海马脑组织，每片厚3μm。
1.4 统计学处理数据均为定量资料，结果用X+S表示。采用SPSS10.0统计软件对A-D组的EEG、电迷宫正确反应率和颞叶海马平均积分光密度进行分析，设定P<0.05有统计学意义。
2结果
2.1 行为学结果8周后，A组大鼠全部达到完全点燃，在注射PTZ后1-3分钟进入潜伏期，大鼠由自由活动状态渐转为安静或躁动，随后出现头面部肌肉抽动，伴点头、全身湿狗样抖动，继而出现前肢阵挛、后肢站立、头转向一侧，最后全身强直-阵挛发作，伴跳跃、撞笼、跌倒和舌咬伤。发作持续数分钟后可短暂缓解，反复发作。
2.2EEG结果组间注射前后总功率差值的分析：偏态分布、方差不齐，多组定量资料，Kruskal-Wallis检验 ， P<0.05，差别有统计学意义。组内注射前后总功率的分析：配对资料的t检验。EEG总功率差值的比较中，B、C、D组与A组的差别有统计学意义(P＜0.05)，B组和D组的差别有统计学意义(P＜0.05)。A组内注射前后的总功率的差别有统计学意义(P＜0.05)。即：PTZ致痫大鼠发作前后EEG功率差异明显，单用VPA、联用VPA和GBE对癫痫EEG都有影响；但是相比于正常组，单用VPA治疗EEG改变不明显。
2.3 Y型电迷宫测试结果第8周末，测得各组大鼠行为正确率数据，多组定量资料的Kruskal-Wallis秩和检验，见表1。A、B、C组与D组的差别有统计学意义(P＜0.05)，A、B、C两两组间差别无统计学意义(P>0.05)。即：癫痫可导致认知受损，VPA和GBE不能改善PTZ致痫大鼠的认知功能。
表1 大鼠Y型电迷宫测试结果
注：与A组比较，*P<0.05；与D组比较，#P<0.05
2.4Cav3.2免疫组化染色结果A组颞叶海马可见明显神经元空泡变性、神经细胞减少，海马锥体细胞排列层次紊乱。B、C组神经元空泡变性及神经细胞减少不明显，海马锥体细胞层次偶见紊乱。D组颞叶海马无异常。由于正常脑组织也存在T型钙通道，因此正常颞叶海马可见少量Cav3.2表达。而对于PTZ致痫大鼠，Cav3.2表达增多，在海马主要分布于CA1、CA3区，在颞叶各层分布无明显差异。实验中以PBS代替一抗作阴性对照，未发现有阳性染色。颞叶Cav3.2表达：A组高于B、C、D组，差别有统计学意义(P＜0.05)；B组高于C、D组，差别有统计学意义(P＜0.05)； D组低于C组，差别有统计学意义(P＜0.05)；即癫痫大鼠颞叶Cav3.2表达显著增加，GBE与VPA联用可显著降低Cav3.2水平，效果优于VPA单一用药。
3讨论
戊四氮慢性點燃大鼠模型与人类颞叶癫痫的行为、脑电图改变、病理及药理特性非常相似。亚惊厥剂量反复诱导即可复制出具有颞叶点燃特征的癫痫模型。海马是点燃模型病理生理改变的主要部位。丙戊酸（VPA）是一种分子量很小的短链脂肪酸，可迅速透过血脑屏障，作为抗癫痫的一线药物，在临床应用广泛，安全性可靠。有研究证实，癫痫大鼠与正常大鼠海马丙戊酸神经药代动力学特征相似，因此使用VPA作为疗效参照，可信性和可操作性高。
国外研究证实，T型Ca2+通道广泛存在于大脑，T型Ca2+通道蛋白Cav3.2介导Ca2+内流，大量Ca2+涌入神经细胞内，引起神经元爆发样放电，从而导致神经细胞损伤。本实验通过对PTZ慢性致痫及生理盐水对照组大鼠癫痫发作等级、EEG及颞叶和海马Cav3.2表达的测定和统计分析，发现慢性癫痫也可导致颞叶和海马T型Ca2+通道蛋白Cav3.2表达显著增多，证明GBE与VPA联用能显著降低Cav3.2水平、减少癫痫发作次数和级别及抑制大脑神经元异常放电，治疗癫痫的效果优于VPA单一用药。为临床使用GBE治疗癫痫提供了基础理论依据。
然而，通过对所有实验大鼠跑电迷宫正确率的统计分析得知VPA和GBE不能改善PTZ致痫大鼠的认知功能。但是在临床工作中，发现GBE在一定程度上改善了生活质量，得到广大患者的认可。Atilla Ilhan等[7]研究发现相比于生理盐水治疗组和丙戊酸治疗组，EGb761治疗小鼠对戊四氮的反应明显减弱。丙戊酸显著延长发作潜伏期。EGb761预治疗组显著免除PTZ诱导的痉挛行为。EGb761和丙戊酸显著降低PTZ所致的大脑组织氧化损伤。在所研究的物质中，EGb761是保护PTZ所致氧化损害最有效地物质。本实验检测30次迷宫，测得行为正确率，过程简单，没有测潜伏期、总反应时间和学会指标，可能有局限性。
参考文献
[1] Diehl RG, Smialowski A, Gotwo T. DeveloPment and Persistence of kindled seizures after rePeated injections of Pentylenetetrazol in rats and guinea Pigs. EPilePsia, 1984, 25(4): 506-510.
[2] 朱蔚文，丁松林，陆雪芬，等. 丙戊酸钠影响癫痫大鼠脑细胞凋亡的剂量. 中国色环境科学杂志，2004, 20(6): 437-440.
[3] 孔庆霞，孙圣刚，李宪章，等. 银杏叶提取物对戊四氮诱导的癫痫发作的脑保护研究. 中国神经精神疾病杂志，2008, 8(2): 118-121.
[4] Racine RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulation. Ⅱ. Motor eizure. ElectroencePhalogr Clin NeuroPhysiol. 1972, 32(3): 281-294.
[5] 王跃春. Y型电迷宫在大鼠学习记忆功能测试中的合理运用. 中国行为医学科学，2005, 14(1): 69-70.
[6] 王跃春，王子栋.大鼠Y型迷宫测试指标正常值的确定. 方法与技术·论著. 333-335.
[7] Atilla Ilhan, Mustafa Iraz, etc. Pentylenetetrazol-induced kindling seizure attenuated by Ginkgo biloba extract (EGb 761) in mice. Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry 30 (2006) 1504–1510.
【关键词】戊四氮（PTZ）；银杏叶提取物（GBE）；丙戊酸（VPA）；脑电图（EEG）；电迷宫
癫痫是由大脑神经元突然过度异常放电所致的反复短暂中枢神经系统功能失常为特征的慢性疾病，严重危害人类健康。其发病机制复杂，治疗靶点多样。当前的研究趋势之一是寻找具有神经保护作用的新型抗癫痫药。近年来，具有明显神经保护作用的银杏叶提取物(GBE)广泛用于心脑血管疾病的防治，仅少量涉及GBE对癫痫的干预。本实验用GBE、VPA干预戊四氮致痫大鼠，通过对其癫痫发作、认知功能和T型Ca2+通道蛋白Cav3.2表达的观察，探究GBE对癫痫发作的影响及发作后脑损伤的保护作用。
1材料和方法
1.1试剂和仪器 PTZ、Anti-Calcium Channel Cav3.2 (a1H)（Sigma公司），兔SP检测试剂盒SP-9001（北京中杉金桥生物技术有限公司），GBE（法国博福—益普生制药工业公司，含24%黄酮糖苷，6%萜类，其中银杏苦内酯占3.1%，白果内酯(又称银杏内酯)占2.9%），日本光电4371F脑电图机，MG-20/3C 迷宫刺激器（张家港市生物医学仪器厂），德国Lecia显微照像系统，Biosens Digital Imaging Systemv1.6分析系统。
1.2动物分组及模型制作成年雄性SD大鼠40只，体重250g左右，河南省实验动物中心提供，按随机数字表法分为4组，每组10只。PTZ致痫组、PTZ+丙戊酸（VPA）組、PTZ+VPA+ GBE组、生理盐水（NS）对照组，分别标记为A组、B组、C组、D组。A-C组按照Diehl[5]的方法制作大鼠点燃模型，即按35mg/kg腹腔注射（ip）10g/L PTZ生理盐水溶液，每日一次；B组在ip PTZ之前1小时给予丙戊酸80mg/kg[2]灌胃（ig）；C组在ip PTZ之前1.5小时给予银杏叶提取物100mg/kg[3] ，ip PTZ之前1小时给予丙戊酸80mg/kg ig；D组按3.5ml/kg腹腔注射生理盐水，每日一次。各组于每天下午3点开始用药，实验周期为8周，其中C组在腹腔注射PTZ之前的3天只给予GBE。
1.3观察方法
1.3.1 大鼠行为学评估指标根据Racine分级法观察痫性发作级别：0 级：无抽搐发作；Ⅰ级：面部痉挛；Ⅱ级：面部痉挛+节律性点头；Ⅲ级：面部痉挛+节律性点头+前肢阵挛；Ⅳ级：面部痉挛+节律性点头+前肢阵挛+后肢站立；Ⅴ级：面部痉挛+节律性点头+前肢阵挛+后肢站立+跌倒；连续3天出现Ⅳ级发作或达到Ⅴ级发作判定为完全点燃。观察并记录大鼠腹腔注射PTZ或生理盐水后1小时内，每只大鼠的行为学变化。
1.3.2 脑电图描记第八周末对40只实验大鼠进行EEG描记。方法为：用粗棉线套住大鼠4只脚固定于木板上，将3根特制针电极分别插入大鼠前额、左右颞叶部位头皮下，使三个插入点成为等腰三角形状，其中顶角为参考电极，用胶带固定电极和电线。
1.3.3 Y型电迷宫正确率测定第8周，对40只SD大鼠进行电迷宫测试。Y型电迷宫，又称三等分辐射式迷路箱,设置电压50-100V，延迟时间5秒。实验开始时，不通电，随机选择一臂作为起步区，将大鼠置于起步区，由于好奇心大鼠在三臂中探索3-5分钟，待大鼠稳定后将其放回起步区。选择起步区所之外任一区作为安全区，按下其对应的按键，安全区灯亮后5秒时，电刺激开始，大鼠最终逃到亮灯的安全区，30秒后熄灯，一次测试结束。
1.3.4 免疫组化染色在描记EEG后，各组大鼠10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔麻醉，10%甲醛全身灌注固定，然后断头取脑，将大脑置于10%甲醛中室温固定36小时，常规石蜡包埋。用切片机连续冠状切取颞叶海马脑组织，每片厚3μm。
1.4 统计学处理数据均为定量资料，结果用X+S表示。采用SPSS10.0统计软件对A-D组的EEG、电迷宫正确反应率和颞叶海马平均积分光密度进行分析，设定P<0.05有统计学意义。
2结果
2.1 行为学结果8周后，A组大鼠全部达到完全点燃，在注射PTZ后1-3分钟进入潜伏期，大鼠由自由活动状态渐转为安静或躁动，随后出现头面部肌肉抽动，伴点头、全身湿狗样抖动，继而出现前肢阵挛、后肢站立、头转向一侧，最后全身强直-阵挛发作，伴跳跃、撞笼、跌倒和舌咬伤。发作持续数分钟后可短暂缓解，反复发作。
2.2EEG结果组间注射前后总功率差值的分析：偏态分布、方差不齐，多组定量资料，Kruskal-Wallis检验 ， P<0.05，差别有统计学意义。组内注射前后总功率的分析：配对资料的t检验。EEG总功率差值的比较中，B、C、D组与A组的差别有统计学意义(P＜0.05)，B组和D组的差别有统计学意义(P＜0.05)。A组内注射前后的总功率的差别有统计学意义(P＜0.05)。即：PTZ致痫大鼠发作前后EEG功率差异明显，单用VPA、联用VPA和GBE对癫痫EEG都有影响；但是相比于正常组，单用VPA治疗EEG改变不明显。
2.3 Y型电迷宫测试结果第8周末，测得各组大鼠行为正确率数据，多组定量资料的Kruskal-Wallis秩和检验，见表1。A、B、C组与D组的差别有统计学意义(P＜0.05)，A、B、C两两组间差别无统计学意义(P>0.05)。即：癫痫可导致认知受损，VPA和GBE不能改善PTZ致痫大鼠的认知功能。
表1 大鼠Y型电迷宫测试结果
注：与A组比较，*P<0.05；与D组比较，#P<0.05
2.4Cav3.2免疫组化染色结果A组颞叶海马可见明显神经元空泡变性、神经细胞减少，海马锥体细胞排列层次紊乱。B、C组神经元空泡变性及神经细胞减少不明显，海马锥体细胞层次偶见紊乱。D组颞叶海马无异常。由于正常脑组织也存在T型钙通道，因此正常颞叶海马可见少量Cav3.2表达。而对于PTZ致痫大鼠，Cav3.2表达增多，在海马主要分布于CA1、CA3区，在颞叶各层分布无明显差异。实验中以PBS代替一抗作阴性对照，未发现有阳性染色。颞叶Cav3.2表达：A组高于B、C、D组，差别有统计学意义(P＜0.05)；B组高于C、D组，差别有统计学意义(P＜0.05)； D组低于C组，差别有统计学意义(P＜0.05)；即癫痫大鼠颞叶Cav3.2表达显著增加，GBE与VPA联用可显著降低Cav3.2水平，效果优于VPA单一用药。
3讨论
戊四氮慢性點燃大鼠模型与人类颞叶癫痫的行为、脑电图改变、病理及药理特性非常相似。亚惊厥剂量反复诱导即可复制出具有颞叶点燃特征的癫痫模型。海马是点燃模型病理生理改变的主要部位。丙戊酸（VPA）是一种分子量很小的短链脂肪酸，可迅速透过血脑屏障，作为抗癫痫的一线药物，在临床应用广泛，安全性可靠。有研究证实，癫痫大鼠与正常大鼠海马丙戊酸神经药代动力学特征相似，因此使用VPA作为疗效参照，可信性和可操作性高。
国外研究证实，T型Ca2+通道广泛存在于大脑，T型Ca2+通道蛋白Cav3.2介导Ca2+内流，大量Ca2+涌入神经细胞内，引起神经元爆发样放电，从而导致神经细胞损伤。本实验通过对PTZ慢性致痫及生理盐水对照组大鼠癫痫发作等级、EEG及颞叶和海马Cav3.2表达的测定和统计分析，发现慢性癫痫也可导致颞叶和海马T型Ca2+通道蛋白Cav3.2表达显著增多，证明GBE与VPA联用能显著降低Cav3.2水平、减少癫痫发作次数和级别及抑制大脑神经元异常放电，治疗癫痫的效果优于VPA单一用药。为临床使用GBE治疗癫痫提供了基础理论依据。
然而，通过对所有实验大鼠跑电迷宫正确率的统计分析得知VPA和GBE不能改善PTZ致痫大鼠的认知功能。但是在临床工作中，发现GBE在一定程度上改善了生活质量，得到广大患者的认可。Atilla Ilhan等[7]研究发现相比于生理盐水治疗组和丙戊酸治疗组，EGb761治疗小鼠对戊四氮的反应明显减弱。丙戊酸显著延长发作潜伏期。EGb761预治疗组显著免除PTZ诱导的痉挛行为。EGb761和丙戊酸显著降低PTZ所致的大脑组织氧化损伤。在所研究的物质中，EGb761是保护PTZ所致氧化损害最有效地物质。本实验检测30次迷宫，测得行为正确率，过程简单，没有测潜伏期、总反应时间和学会指标，可能有局限性。
参考文献
[1] Diehl RG, Smialowski A, Gotwo T. DeveloPment and Persistence of kindled seizures after rePeated injections of Pentylenetetrazol in rats and guinea Pigs. EPilePsia, 1984, 25(4): 506-510.
[2] 朱蔚文，丁松林，陆雪芬，等. 丙戊酸钠影响癫痫大鼠脑细胞凋亡的剂量. 中国色环境科学杂志，2004, 20(6): 437-440.
[3] 孔庆霞，孙圣刚，李宪章，等. 银杏叶提取物对戊四氮诱导的癫痫发作的脑保护研究. 中国神经精神疾病杂志，2008, 8(2): 118-121.
[4] Racine RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulation. Ⅱ. Motor eizure. ElectroencePhalogr Clin NeuroPhysiol. 1972, 32(3): 281-294.
[5] 王跃春. Y型电迷宫在大鼠学习记忆功能测试中的合理运用. 中国行为医学科学，2005, 14(1): 69-70.
[6] 王跃春，王子栋.大鼠Y型迷宫测试指标正常值的确定. 方法与技术·论著. 333-335.
[7] Atilla Ilhan, Mustafa Iraz, etc. Pentylenetetrazol-induced kindling seizure attenuated by Ginkgo biloba extract (EGb 761) in mice. Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry 30 (2006) 1504–1510.