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【摘要】 目的：研究慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者肠源性内毒素血症（intestinal endotoxemia，IETM）中与调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）、Th17细胞相关免疫调节细胞因子的表达变化。方法：应用ELISA法分别对80例CHB患者和20例健康对照者的血浆IL-10、TGF-β、IL-6、IL-17、IL-23及内毒素水平进行检测。根据测定的内毒素水平，将CHB患者分为内毒素阳性组和内毒素阴性组。结果：CHB患者血浆IL-10、TGF-β、IL-6、IL-17、IL-23水平均明显高于健康对照组（Z值分别为5.265、6.859、6.894、5.028、6.877，均P<0.01）。内毒素阳性组患者明显高于内毒素阴性组和健康对照组（H值分别为45.833、48.423、48.984、75.184、75.814，均P<0.01）。结论：CHB患者IETM时血浆中与Treg、Th17细胞相关细胞因子水平进一步增高。
【关键词】 乙型肝炎； 慢性； 肠源性内毒素血症； 细胞因子
Change of Immunological Cytokines Expression in Chronic Hepatitis B Patients with Intestinal Endotoxemia/WANG Jian-hong，LI Hong，ZHAO Long-feng.//Medical Innovation of China，2014，11（12）：020-022
【Abstract】 Objective：To investigate the change of the Treg/Th17-related cytokines in chronic hepatitis B patients with intestinal endotoxemia.Method：The serum levels of Treg/Th17-related cytokines and endotoxin（ET）in 80 patients with chronic hepatitis B（CHB） and 20 healthy controls（NC） were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）.According to serum ET levels，all CHB patients were divided into two groups： ET positive and ET negative.Result：Compared to NC，the serum concentration of IL-10，TGF-β，IL-6，IL-17，IL-23 were all significantly increased in CHB patient groups（Z=5.265，6.859，6.894，5.028，6.877，all P<0.01）.The levels of IL-10，TGF-β，IL-6，IL-17，IL-23 in ET positive group were significantly higher than ET negative group and NC（H=45.833，48.423，48.984，75.184，75.814，all P<0.01）.Conclusion：The Treg/Th17-related cytokines were increased in CHB patients with intestinal endotoxemia.
【Key words】 Hepatitis B； Chronic； Intestinal endotoxemia； Cytokines
First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.12.007
乙型肝炎病毒（HBV）是一种在世界范围广泛流行、严重危害人类健康的传染病[1]。HBV感染后致肝脏损害主要由机体对HBV免疫应答介导[2]。目前，HBV感染后慢性化进程中免疫应答的确切机制还不清楚，但可以肯定的是细胞免疫在其中起重要作用。调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）、Th17细胞是近年来新发现的两类免疫调节细胞，两者密切相关，来源与同一初始CD4+ T淋巴细胞群，在分化和功能上既相互联系，又相互制约[3]。Treg/Th17细胞失衡可导致多种慢性感染性疾病、自身免疫疾病及肿瘤等的发生、发展。已有研究报道，慢性乙型肝炎（CHB）患者体内亦存在Treg/Th17失衡，参与HBV感染慢性化的进程[4-5]。笔者前期研究发现，CHB患者体内长期持续患有肠源性内毒素血症（intestinal endotoxemia，IETM）时可以导致机体的免疫功能低下，造成HBV难以清除[6]。那IETM与Treg/Th17平衡关系如何呢？本研究通过检测内毒素水平，将CHB患者分为内毒素阳性组和内毒素阴性组，通过比较两组患者外周血Treg、Th17细胞相关细胞因子的的水平，间接探讨IETM中CHB患者外周血Treg/Th17平衡的改变。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2013年2月-2013年11月在本院住院的80例CHB患者，其中男58例，女22例，年龄18～69岁，平均（30±6）岁。CHB患者诊断均符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2010年版）[7]，近半年均未服用过抗病毒及免疫调节剂药物，排除其他肝炎病毒感染及其他原因引起的肝损害。同时选取20例健康对照者，男14例，女6例，年龄20～55岁，平均（25±9）岁，肝功能正常，HBV血清学标志物阴性。本研究经本院医学伦理委员会同意，所有患者均签署知情同意书。两组研究对象一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。 1.2 检测方法 抽取受试对象晨间空腹静脉血1 mL，离心分离血清，-20 ℃保存。待所有样本收集完全后，取冻存血清，ELISA双抗体夹心法检测血浆IL-10、TGF-β、IL-6、IL-17、IL-23及内毒素水平。根据检测的内毒素水平，将CHB患者分为内毒素阳性组和阴性组，内毒素阳性的标准为健康者内毒素水平95%可信区间的上限值36.68 pg/mL，>36.68 pg/mL为内毒素阳性组，≤36.68 pg/mL为内毒素阴性组。
1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示；采用两个样本比较的Mann-Whitney U检验或多个独立样本比较的Kruskal-Wallis H检验；以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 健康者与CHB患者内毒素、IL-10、TGF-β水平的比较 80例CHB患者中，45例发生IETM，占56.25%。内毒素阳性组与阴性组的年龄、性别比较差异均无统计学意义（P>0.05）。与健康者比较，CHB患者内毒素水平明显升高（P<0.01），且IL-10、TGF-β水平均明显升高（Z值分别为5.265、6.859）。内毒素阳性组IL-10、TGF-β水平均较阴性组升高，差异均有统计学意义（P<0.01），见表1。
2.2 健康者与CHB患者IL-6、IL-17、IL-23水平的比较 与健康者比较，CHB患者IL-6、IL-17、IL-23水平均明显升高（Z值分别为6.894、5.028、6.877）。内毒素阳性组IL-6、IL-17、 IL-23水平均较阴性组升高，差异有统计学意义（P<0.01），见表2。
3 讨论
TGF-β不仅是Treg分泌的发挥抑制作用的主要细胞因子，体外研究还表明相对较低浓度的TGF-β主要促进Th17细胞的分化，而高浓度的TGF-β则主要促进Treg的分化而抑制Th17细胞的分化[8]。IL-10是Treg分泌的另一主要细胞因子，它可调控IL-12的产生，进而抑制Th1型细胞免疫反应[3]。有研究表明，CHB患者血浆TGF-β、IL-10水平明显升高，且与病情严重程度密切相关[3]。本研究发现与健康对照组比较，CHB患者TGF-β、IL-10水平亦均明显升高，按内毒素水平分组后，内毒素阳性组二者均明显高于内毒素阴性组，初步提示内毒素可影响CHB患者TGF-β、IL-10的表达水平，二者可能参与了IETM的病变过程。
IL-6联合TGF-β可促进转录因子RORt的表达和STA-T3通路的活化，从而可诱导Th17细胞的分化与增殖[9]。在关于糖尿病的研究中发现，IL-6不仅可诱导Th17细胞的分化与增值，且可以抑制Treg的分化，使Treg/Th17平衡向Th17方向偏移[10]。IL-23属于IL-12家族，主要由mDC细胞分泌，是维持Th17细胞分化及功能发挥的细胞因子，IL-23缺乏使其存活及增殖受限[11]。IL-17是Th7细胞分泌的主要致炎性细胞因子，可诱导内皮细胞、上皮细胞等分泌IL-6、IL-8、前列腺素E2，增强TNF-α的功能及细胞间黏附分子的表达，在炎症性疾病的发生发展中起重要作用[12]。IL-23/IL-17信号通路参与多种炎性疾病，有研究发现慢性乙型肝炎的病变中亦有IL-23/IL-17信号通路的参与[13]。本发现与健康对照组比较，CHB患者血浆IL-6、IL-23、IL-17水平均明显升高，按内毒素水平分组后，内毒素阳性组三者均明显高于内毒素阴性组，初步提示CHB患者IETM时IL-6、IL-23、IL-17的表达水平亦发生了变化，它们亦可能参与了IETM的病理生理过程。
综上所述，本研究发现，CHB患者IETM时与Treg、Th17细胞密切相关的细胞因子表达均升高，初步提示Treg、Th17细胞可能都参与了IETM的病变过程，下一步笔者将直接研究CHB患者IETM时外周血Treg、Th17细胞表达的变化，为通过降低内毒素水平来改善CHB患者病情提供免疫治疗方面的新视角。
参考文献
[1]林格.核苷类抗乙肝病毒药物的研究进展[J].中国医学创新，2011，8（26）：186-188.
[2]钟大妮，李国坚，吴继周，等.广西地区乙肝病毒基因分型与临床表现及机体免疫功能关系的研究[J].中国医学创新，2013，10（2）：1-3.
[3] Weaver C T，Hatton R D.Interplay between the Th17 and Treg cell lineages：a （co-） evolutionary perspective[J].Nat Rev Immunol，2009，9（12）：883-889.
[4] Xue-Song L，Cheng-Zhong L，Ying Z，et al.Changes of Treg and Th17 cells balance in the development of acute and chronic hepatitis B virus infection[J].BMC Gastroenterol，2012，12（1）：43.
[5] Su Z J，Yu X P，Guo R Y，et al.Changes in the balance between Treg and Th17 cells in patients with chronic hepatitis B[J].Diagn Microbiol Infect Dis，2013，76（4）：437-444.
[6]赵龙凤，李红，王勤英，等.慢性肝炎患者内毒素血症与免疫功能的关系[J].中华传染病杂志，2004，22（1）：45-47. [7]中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）[J].中华临床感染病杂志，2011，4（1）：1-13.
[8] Zhou L，Lopes J E，Chong M M，et al.TGF-β-induced Foxp3 inhibits Th17 cell differentiation by antagonizing RORγ function[J].Nature，2008，453（7192）：236-240.
[9] Mangan P R，Harrington L E，O’Quinn D B，et al.Transforming growth factor-β induces development of the TH17 lineage[J].Nature，2006，441（7090）：231-234.
[10] Monika R S，Skrzypkowska M，Mymliwska J，et al.The serum IL-6 profile and Treg/Th17 peripheral cell populations in patients with type 1 diabetes[J].Mediators Inflamm，2013，20（13）：20 524.
[11] Volpe E，Servant N，Zollinger R，et al.A critical function for transforming growth factor-β，interleukin 23 and proinflammatory cytokines in driving and modulating human TH-17 responses[J].Nature Immunol，2008，9（6）：650-657.
[12] Qu N，Xu M，Mizoguchi I，et al.Pivotal roles of T-Helper 17-Related cytokines，IL-17，IL-22，and IL-23，in inflammatory diseases[J].Clin Dev Immuno，2013，25（13）：968 549.
[13] Wang Q，Zhou J，Zhang B，et al.Hepatitis B virus induces IL-23 production in antigen presenting cells and causes liver damage via the IL-23/IL-17 axis[J].Plos Pathog，2013，9（6）：e1003410.
（收稿日期：2014-01-16） （本文编辑：欧丽）
【关键词】 乙型肝炎； 慢性； 肠源性内毒素血症； 细胞因子
Change of Immunological Cytokines Expression in Chronic Hepatitis B Patients with Intestinal Endotoxemia/WANG Jian-hong，LI Hong，ZHAO Long-feng.//Medical Innovation of China，2014，11（12）：020-022
【Abstract】 Objective：To investigate the change of the Treg/Th17-related cytokines in chronic hepatitis B patients with intestinal endotoxemia.Method：The serum levels of Treg/Th17-related cytokines and endotoxin（ET）in 80 patients with chronic hepatitis B（CHB） and 20 healthy controls（NC） were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）.According to serum ET levels，all CHB patients were divided into two groups： ET positive and ET negative.Result：Compared to NC，the serum concentration of IL-10，TGF-β，IL-6，IL-17，IL-23 were all significantly increased in CHB patient groups（Z=5.265，6.859，6.894，5.028，6.877，all P<0.01）.The levels of IL-10，TGF-β，IL-6，IL-17，IL-23 in ET positive group were significantly higher than ET negative group and NC（H=45.833，48.423，48.984，75.184，75.814，all P<0.01）.Conclusion：The Treg/Th17-related cytokines were increased in CHB patients with intestinal endotoxemia.
【Key words】 Hepatitis B； Chronic； Intestinal endotoxemia； Cytokines
First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.12.007
乙型肝炎病毒（HBV）是一种在世界范围广泛流行、严重危害人类健康的传染病[1]。HBV感染后致肝脏损害主要由机体对HBV免疫应答介导[2]。目前，HBV感染后慢性化进程中免疫应答的确切机制还不清楚，但可以肯定的是细胞免疫在其中起重要作用。调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）、Th17细胞是近年来新发现的两类免疫调节细胞，两者密切相关，来源与同一初始CD4+ T淋巴细胞群，在分化和功能上既相互联系，又相互制约[3]。Treg/Th17细胞失衡可导致多种慢性感染性疾病、自身免疫疾病及肿瘤等的发生、发展。已有研究报道，慢性乙型肝炎（CHB）患者体内亦存在Treg/Th17失衡，参与HBV感染慢性化的进程[4-5]。笔者前期研究发现，CHB患者体内长期持续患有肠源性内毒素血症（intestinal endotoxemia，IETM）时可以导致机体的免疫功能低下，造成HBV难以清除[6]。那IETM与Treg/Th17平衡关系如何呢？本研究通过检测内毒素水平，将CHB患者分为内毒素阳性组和内毒素阴性组，通过比较两组患者外周血Treg、Th17细胞相关细胞因子的的水平，间接探讨IETM中CHB患者外周血Treg/Th17平衡的改变。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2013年2月-2013年11月在本院住院的80例CHB患者，其中男58例，女22例，年龄18～69岁，平均（30±6）岁。CHB患者诊断均符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2010年版）[7]，近半年均未服用过抗病毒及免疫调节剂药物，排除其他肝炎病毒感染及其他原因引起的肝损害。同时选取20例健康对照者，男14例，女6例，年龄20～55岁，平均（25±9）岁，肝功能正常，HBV血清学标志物阴性。本研究经本院医学伦理委员会同意，所有患者均签署知情同意书。两组研究对象一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。 1.2 检测方法 抽取受试对象晨间空腹静脉血1 mL，离心分离血清，-20 ℃保存。待所有样本收集完全后，取冻存血清，ELISA双抗体夹心法检测血浆IL-10、TGF-β、IL-6、IL-17、IL-23及内毒素水平。根据检测的内毒素水平，将CHB患者分为内毒素阳性组和阴性组，内毒素阳性的标准为健康者内毒素水平95%可信区间的上限值36.68 pg/mL，>36.68 pg/mL为内毒素阳性组，≤36.68 pg/mL为内毒素阴性组。
1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示；采用两个样本比较的Mann-Whitney U检验或多个独立样本比较的Kruskal-Wallis H检验；以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 健康者与CHB患者内毒素、IL-10、TGF-β水平的比较 80例CHB患者中，45例发生IETM，占56.25%。内毒素阳性组与阴性组的年龄、性别比较差异均无统计学意义（P>0.05）。与健康者比较，CHB患者内毒素水平明显升高（P<0.01），且IL-10、TGF-β水平均明显升高（Z值分别为5.265、6.859）。内毒素阳性组IL-10、TGF-β水平均较阴性组升高，差异均有统计学意义（P<0.01），见表1。
2.2 健康者与CHB患者IL-6、IL-17、IL-23水平的比较 与健康者比较，CHB患者IL-6、IL-17、IL-23水平均明显升高（Z值分别为6.894、5.028、6.877）。内毒素阳性组IL-6、IL-17、 IL-23水平均较阴性组升高，差异有统计学意义（P<0.01），见表2。
3 讨论
TGF-β不仅是Treg分泌的发挥抑制作用的主要细胞因子，体外研究还表明相对较低浓度的TGF-β主要促进Th17细胞的分化，而高浓度的TGF-β则主要促进Treg的分化而抑制Th17细胞的分化[8]。IL-10是Treg分泌的另一主要细胞因子，它可调控IL-12的产生，进而抑制Th1型细胞免疫反应[3]。有研究表明，CHB患者血浆TGF-β、IL-10水平明显升高，且与病情严重程度密切相关[3]。本研究发现与健康对照组比较，CHB患者TGF-β、IL-10水平亦均明显升高，按内毒素水平分组后，内毒素阳性组二者均明显高于内毒素阴性组，初步提示内毒素可影响CHB患者TGF-β、IL-10的表达水平，二者可能参与了IETM的病变过程。
IL-6联合TGF-β可促进转录因子RORt的表达和STA-T3通路的活化，从而可诱导Th17细胞的分化与增殖[9]。在关于糖尿病的研究中发现，IL-6不仅可诱导Th17细胞的分化与增值，且可以抑制Treg的分化，使Treg/Th17平衡向Th17方向偏移[10]。IL-23属于IL-12家族，主要由mDC细胞分泌，是维持Th17细胞分化及功能发挥的细胞因子，IL-23缺乏使其存活及增殖受限[11]。IL-17是Th7细胞分泌的主要致炎性细胞因子，可诱导内皮细胞、上皮细胞等分泌IL-6、IL-8、前列腺素E2，增强TNF-α的功能及细胞间黏附分子的表达，在炎症性疾病的发生发展中起重要作用[12]。IL-23/IL-17信号通路参与多种炎性疾病，有研究发现慢性乙型肝炎的病变中亦有IL-23/IL-17信号通路的参与[13]。本发现与健康对照组比较，CHB患者血浆IL-6、IL-23、IL-17水平均明显升高，按内毒素水平分组后，内毒素阳性组三者均明显高于内毒素阴性组，初步提示CHB患者IETM时IL-6、IL-23、IL-17的表达水平亦发生了变化，它们亦可能参与了IETM的病理生理过程。
综上所述，本研究发现，CHB患者IETM时与Treg、Th17细胞密切相关的细胞因子表达均升高，初步提示Treg、Th17细胞可能都参与了IETM的病变过程，下一步笔者将直接研究CHB患者IETM时外周血Treg、Th17细胞表达的变化，为通过降低内毒素水平来改善CHB患者病情提供免疫治疗方面的新视角。
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[6]赵龙凤，李红，王勤英，等.慢性肝炎患者内毒素血症与免疫功能的关系[J].中华传染病杂志，2004，22（1）：45-47. [7]中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）[J].中华临床感染病杂志，2011，4（1）：1-13.
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[9] Mangan P R，Harrington L E，O’Quinn D B，et al.Transforming growth factor-β induces development of the TH17 lineage[J].Nature，2006，441（7090）：231-234.
[10] Monika R S，Skrzypkowska M，Mymliwska J，et al.The serum IL-6 profile and Treg/Th17 peripheral cell populations in patients with type 1 diabetes[J].Mediators Inflamm，2013，20（13）：20 524.
[11] Volpe E，Servant N，Zollinger R，et al.A critical function for transforming growth factor-β，interleukin 23 and proinflammatory cytokines in driving and modulating human TH-17 responses[J].Nature Immunol，2008，9（6）：650-657.
[12] Qu N，Xu M，Mizoguchi I，et al.Pivotal roles of T-Helper 17-Related cytokines，IL-17，IL-22，and IL-23，in inflammatory diseases[J].Clin Dev Immuno，2013，25（13）：968 549.
[13] Wang Q，Zhou J，Zhang B，et al.Hepatitis B virus induces IL-23 production in antigen presenting cells and causes liver damage via the IL-23/IL-17 axis[J].Plos Pathog，2013，9（6）：e1003410.
（收稿日期：2014-01-16） （本文编辑：欧丽）