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摘要：在厌氧条件下，分别以葡萄糖、甲醇和邻苯二甲酸氢钾作为电子供体对NO3-N进行厌氧反硝化实验，每种电子供体设定两个C/N比，分别为4 ∶1和10 ∶1.实验结果表明：在2种C/N比情况下，葡萄糖与甲醇作为电子供体时，总氮的去除速率一致，且都比邻苯二甲酸氢钾作为电子供体时要快.当C/N=4时，总氮的去除速率要快71%，而当C/N=10时，总氮的去除速率的差距只有7%.不同有机物作为反硝化的电子供体时，活性污泥样本中的微生物菌落检出情况表现出3个反应体系中具有各自优势的厌氧菌群、硝化及反硝化菌群明显特征.该微生物群落的分布特点反映出不同有机物作为电子供体时反应系统状态的差异性.
关键词：电子供体； 反硝化； 生物脱氮； 微生物群落
中图分类号： X 506 文献标志码： A 文章编号： 10005137（2016）01009409
0 前 言
化肥制造、燃料生产、肉类加工等工业排放的废水中一般均含有高浓度的氨氮、硝酸盐或亚硝酸盐，通常采用A/O或A2/O等工艺来对这类废水进行总氮的去除[1-2].采用A/O或A2/O工艺时，氨氮需要通过硝化、反硝化两阶段进行总氮的去除，这一过程需要消耗大量的溶解氧和碳源.因此，为了在脱氮过程中降低溶解氧的消耗和解决反硝化过程中碳源不足的问题，人们探索出同步硝化反硝化[3-4]、短程硝化反硝化[5-6]、厌氧氨氧化[7]等工艺方法，避免全程硝化反应以节省动力消耗，尤其是减少有机碳源的消耗，而提高污水中本身含有的碳源在反硝化过程中的利用是最为经济的方式.因此，提高有机碳源（电子供体）的利用效率已成为当今废水脱氮技术亟待解决的问题之一.很早就有研究发现，厌氧反应系统在一定条件下可以达到硝酸盐的良好去除[8-9]，当有适当碳源提供时，硝酸盐的反硝化脱氮反应可以顺利进行，实验数据显示在厌氧反应器中，当硝酸盐进水浓度为20～410 mg/L时脱氮效率可以达到89%～98%，有的情况下甚至可以达到硝酸盐的彻底去除.
在通常的生物脱氮过程中，除了提供一定的有机碳源作为电子供体之外，还需确保反应体系有一定的厌氧条件，即确保其溶解氧在一定的浓度之下.通常在厌氧体系中，往往会伴随着甲烷的产生.有人在研究UASB和MBR组成的硝化反硝化系统时，在UASB反应中观测到明显的，有机碳源被反硝化过程利用，从而降低了甲烷产量[5].进一步有研究证实，在厌氧反应体系中常常伴随着导致甲烷氧化的现象，即厌氧过程中产生的甲烷在硝酸盐氮存在的条件下可被氧化，并导致脱氮现象[10].从废水脱氮角度考虑，厌氧环境中甲烷氧化作为反硝化的电子供体，可在很大程度上解决碳源不足的问题.
通常生物反应体系可以通过适当的操作或控制实现所设定的缺氧条件，而选择何种碳源就成为反硝化脱氮的关键因素.本研究分别以甲醇、葡萄糖和邻苯二甲酸氢钾作为有机碳源，加入到硝酸盐为营养物质厌氧反应器中，在不同碳氮比的条件下建立厌氧反硝化体系，并在测定其反硝化反应效率的基础上，对微生物体系中微生物群落分布进行系统分析.同时借助分析反应系统中微生物群落组成的规律，判断反硝化系统中微生物对有机物及营养物质利用的状态.本研究拟通过反应器运行效果分析结合微生物群落状态的分析，解析厌氧条件下总氮去除的机理，并有利于在工程应用上采取有效的控制手段保持微生物体系的高效运行.
1 材料与方法
1.1 溶液制备
实验用水采用人工配置，在自来水中加入含有碳源、硝酸盐、磷营养元素及微量元素的配制溶液.实验溶液配制用水为MilliQ Integral水纯化系统制备的纯水.微量元素混合溶液组成（g/L）为：FeCl2·4H2O 1.5，NiCl2·6H2O 0.024，CoCl2·6H2O 0.19，CuCl2·2H2O 0.002，MnSO4·7H2O 0.1，Na2MoO4·2H2O 0.024，ZnCl2 0.07，H3BO3 0.006.试验用葡萄糖、邻苯二甲酸氢钾、甲醇、硝酸钠、磷酸二氢钾和碳酸氢钠等药剂均为分析纯，购自上海国药集团.
1.2 活性污泥驯化
活性污泥来源为上海龙华水质净化厂的二沉池污泥.在500 mL的摇瓶里采用葡萄糖为碳源进行培养和驯化，当污泥沉降性能达到SV30，上清液清澈，且对COD的降解效率稳定在70%以上后，将此活性污泥定量加入3个250 mL的锥形瓶里，分别采用葡萄糖、甲醇和邻苯二甲酸氢钾进行反硝化污泥的驯化.控制COD从400 mg/L 逐渐增加至1000 mg/L，NO3-N从20 mg/L逐步增加到100 mg/L.实验过程中C/N比为4和10，N/P比始终保持在5 ∶1.反应过程中摇瓶采用充氮气方式排除液体上方氧气并封口，将锥形瓶里的溶解氧控制在0.5～1.0 mg/L以下.反应中采用磁力搅拌器进行搅拌，保持污泥和溶液的良好混合状态，采用续批式运行，反应换水周期为24 h.当60 mg/L的NO3-N在12 h的反应时间内达到80%以上的去除率时，认为生物反硝化驯化完成.
1.3 反应装置运行
分别用葡萄糖、甲醇和邻苯二甲酸氢钾作为碳源，将驯化好的污泥分别放置在3个250 mL的锥形瓶内，并加入微量元素等其他所需营养元素进行反硝化实验.硝酸盐的生物降解实验中的3种碳源分别采用的C/N比为4和10.当NO3-N的初始浓度为60 mg/L时，分别以C6H12O6、CH3OH和C8H5KO4为碳源进行序批式反应，反应时间根据需要设定.实验中定时间取样，水样均经过0.22 m的水系膜过滤后进行测试分析.
反硝化动力学实验以C6H12O6、CH3OH和C8H5KO4为碳源，设置不同NO3-N初始浓度在30～210 mg/L之间进行反硝化实验，测试NO3-N在反应最初10 min内的浓度变化进行动力学研究.实验中定时间取样，水样经过0.22 m的水系膜过滤后进行测试分析. 1.4 分析方法
NO3-用DIONEX ICS5000离子色谱进行分析，所得结果再转化为NO3-N.COD参照《水和废水监测分析方法》（中国环境科学出版社，2002年，第四版）中重铬酸钾法.
在实验结束时，分别从以葡萄糖、甲醇、邻苯二甲酸氢钾为碳源的反应系统中提取稳定的活性污泥样本，低温密封保存在离心管中，分别标注为Glc（葡萄糖）样本，MeOH （甲醇）样本和KHP（邻苯二甲酸氢钾）样本.在24 h内送至上海捷瑞生物有限公司进行分子生物学分析.使用DNAzol试剂抽提微生物DNA以作为PCR反应的模板，测试分析采用的通用引物为细菌16Sr DNA：F （5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′）和R （5′CAKAAAGGAGGTGATCC3′）.
2 结果与讨论
2.1 有机碳源对总氮去除速率的影响
分别采用葡萄糖（Glc）、甲醇（MeOH）和邻苯二甲酸氢钾（KHP）作为有机碳源添加入含氮废水中，在C/N比分别为4和10进行的反硝化实验，其结果如图1所示.从图1可以看出，TN去除速率可以用分数级反应动力学r=-dCdt=kCα进行描述.该式经过积分可以得到TN浓度C与反应级数α、反应速率常数k和时间t的关系为：C=[C1-α0-kt（1-α）]11-α.相关动力学参数可以通过试差法得到，其结果如表1所示.
当C/N比为4时，无论以哪种有机物作为电子供体，其反硝化速率都较低.此时的反应级数为α=0.33，以葡萄糖和甲醇为电子供体时，其TN去除速率常数均为0.96 （mg·L-1）0.87·h-1，而以邻苯二甲酸氢钾为电子供体时，其常数为：0.56 （mg·L-1）0.87·h-1.即以葡萄糖和甲醇为碳源时，TN去除速率比以邻苯二甲酸氢钾时高出71%.
当C/N=10时，总氮去除速率明显提高，此时的反应级数提高到了0.83，以葡萄糖和甲醇为电子供体时，其TN去除速率常数均为0.62 （mg·L-1）0.87·h-1，以邻苯二甲酸氢钾为电子供体时，其常数为：0.58 （mg·L-1）0.87·h-1.此时，不同有机物作为电子供体时，他们对TN去除速率的效率较为接近.这一实验结果表明，当有机碳源充足时，有机物种类的影响不是主要的.而当C/N较小时，有机物种类对TN的去除速率影响较大.
当反应器HRT为12 h时，以葡萄糖、甲醇和邻苯二甲酸氢钾为电子供体的总氮及硝酸盐氮去除情况如图2所示.C/N=10时，葡萄糖、甲醇和邻苯二甲酸氢钾的总氮及硝酸盐氮去除率分别为95.2%、95.4%、99.7%和95.4%、100%、100%；当反应器HRT为12 h、C/N=4时，葡萄糖、甲醇和邻苯二甲酸氢钾的总氮及硝酸盐氮去除率分别为47.6%、57.9%、37.4%和66.5%、58.4%、40.2%.可见，C/N=10时不同电子供体的TN和NO3-的去除基本同步；C/N=4时甲醇和邻苯二甲酸氢钾则基本同步，但以葡萄糖为底物的反应器中的NO3-的去除率比TN去除率多出18.9%，表明葡萄糖为底物时NO3-虽然降解了，但并未被反硝化脱氮，这18.9%的转化后的NO3-可能以NO2-或NH4+的形式表现在TN中.因此，虽然从动力学角度看C/N=4时葡萄糖和甲醇的TN去除动力学常数k均为0.96，但从NO3-N反硝化转化率看，甲醇和邻苯二甲酸氢钾作为电子供体时的NO3-和TN的去除基本同步，脱氮效率明显高于葡萄糖；C/N=10时，可能源于同化作用时需要消耗更多的N源，NO3-和TN的去除在整个反应过程中同步进行，反应结束时去除率介于95%～100%，NO3-和TN同步消耗殆尽.推测由于碳氮比较高，底物氮源同化作用较强，在TN的去除上，不同的电子供体间没有显示出明显差异.
2.2 有机碳源微生物群落分布之间的关系
反应器中微生物样品A、B与C中的细菌基因组DNA抽提后进行PCR扩增，扩增产物经电泳分离纯化后克隆到PMD18T载体上.为了鉴定活性污泥的菌种组成，所有样品随机挑选了100个克隆测序.测序结果根据GenBank数据库进行BLAST比对（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）.
从表2的3个样本的测序分析结果可以看出，葡萄糖为碳源的活性污泥克隆样本中的微生物群落种类较为丰富，统计测序结果得出总共有31个相关菌种；甲醇为碳源的活性污泥克隆样本中检出不同菌属25种；邻苯二甲酸氢钾为碳源的活性污泥克隆样本中检出了不同菌属19种.Glc样本、MeOH样本、KHP样本的优势菌属占比分别如图3所示.
在Glc、MeOH及KHP的3个污泥克隆样本中Anaerolinea thermophile菌株的检出占比分别为10%、4%、8%，为典型的嗜热厌氧菌属；3个污泥克隆样本中菌株Rhodopirellula baltica SH1的检出占比分别为2%、8%、6%，为浮霉菌门的红小梨形菌属，是一种专性厌氧产氢菌[11].Thioalkalivibrio sp.K90mix在3个样本中的检出比分别为2%、2%、2%，该菌属为专性化能自养微生物，可产生亚硝酸还原酶，说明3个处于厌氧状态的反应器中均存在微生物的对NO3-的脱氮行为[12].此外，3个样本中均含有Paracoccus denitrificans、Aromatoleum aromaticum、Mesorhizobium sp.等各类反硝化菌属[13].表明3个序批式反应器厌氧状态良好，并且存在微生物的脱氮行为.3个样本中Alkaliphilus metalliredigens QYMF的占比分别为5%、8%、3%，表明有机物降解通过碱性无氧呼吸进行[14]，而无氧呼吸的特点是以无机氧化物为最终电子受体，如NO3-、SO42-、CO2等，从而也可判断出系统的反硝化行为. 在以MeOH和KHP为电子供体的污泥样本中，Thauera sp. MZ1T的占比分别达到25%和36%，Glc样本中仅为2%.Thauera sp. MZ1T已知可以以硝酸盐为电子受体，并以多种芳香族有机物为电子供体进行反硝化反应，使厌氧反应产生的部分有机物中间产物被反硝化反应利用，降低了有机物在厌氧环境中被转化为甲烷的总量[15].Glc样本中虽然Thauera sp. MZ1T不是优势菌属，但其Candidatus Accumulibacter phosphatis clade的占比最高，为29%；在MeOH样本及KHP样本中，Candidatus Accumulibacter phosphatis的占比也分别达到9%及22%，均为优势菌株.本实验配水中始终保持N ∶P为5 ∶1的比例，由于反应器处于良好的厌氧状态，氮磷的供给均为过量，已知Candidatus Accumulibacter phosphatis是反硝化除磷系统中的典型优势菌属，在厌氧条件在体内储存过量的磷酸盐，同时以硝酸盐为电子受体进行反硝化脱氮[16-17].因此，从微生物群落特点也可以判断出反应器底物中存在充分的氮磷营养，在3个不同有机底物的反应器内均积累了大量的厌氧反硝化除磷微生物.
从部分被检出的菌株的生长代谢特点，也可以分析了解其对反应器中有机物的降解的特点及基本降解途径.Pedobacter heparinus在MeOH样本及KHP样本中的占比均为6%，为优势菌属，但在Glc样本中未检出，该细菌是最先被分离鉴别的可以利用肝磷酯作为唯一碳源和氮源而生长的鞘脂杆菌科菌属，可以产生多种裂解酶，包括可以降解黏多糖的酶类[18]，有利于有机物及其中间产物的分解.在污泥样本MeOH中Aromatoleum aromaticum达7%，属优势菌株.该菌株是含有短链醇脱氢酶的反硝化细菌，可以对各种有机醇类进行脱氢氧化[19]，说明甲醇底物降解是通过甲醇脱氢氧化为不饱和烃甲醛的这一途径进行的.而在Glc、MeOH及KHP样本中Beijerinckia indica subsp.的检出占比分别为2%、4%、4%，Beijerinckia indica是典型的甲烷营养型菌属，甲烷营养型菌属通常被分为I型和II型.Beijerinckia indica为II型甲烷氧化菌，仅以甲烷、甲醇为唯一的碳源和能源进行生长，但也有研究发现这一菌属中存在兼性营养型甲烷氧化菌可以利用乙酸等基质[20].本研究中采用的3个反应器均处于隔绝空气状态，系统的微生物菌落结构也证明了反应器的厌氧环境良好，反应系统中的甲烷氧化菌氧化有机物的氧来源仅能依靠配水中的NO3-提供，因此可以判断甲烷氧化菌Beijerinckia indica通过利用硝酸盐中的氧将甲烷进行单加氧反应生成甲醇，再氧化为甲醛；然后甲醛可通过丝氨酸途径同化，或被氧化为甲酸后再矿化为二氧化碳[21-22].
另外，在反应系统中还检出一些特殊菌属，如Glc、MeOH样本中检出了Acidimicrobium ferrooxidans菌株，属于放线菌门酸微菌目的酸微菌属.嗜酸细菌通常以硫和亚铁营自养生活，可以以氢作为电子供体生长[23]，而A.ferrooxidans可在葡萄糖酵母提取物等底物中混合营养生长[24].在MeOH样本中占比4%的约氏黄杆菌Flavobacterium johnsoniae具有分泌内切酶进行催化水解的能力[25].此外，3个样本中分别检测出1%～3%的脱卤菌属Dehalococcoides sp.，是含有卤代有机物的底物中的常见菌属[26]，但其在厌氧脱氮反应系统中的功能有待研究.总体上看，污泥样本中的微生物菌落检出情况可以反应出反应器的运行状况，3个反应器中厌氧菌群、硝化及反硝化菌群特征明显；Aromatoleum aromaticum、Candidatus Accumulibacter phosphatis等菌属的存在也反映出底物磷过剩和底物种类的影响；Beijerinckia indica subsp.可以看出厌氧过程进行到了产甲烷过程.因此，从微生物群落分布特征可以对反应器运行状况作出定性的判断.
从底物电子供体分析，在3个样本中检出的相同菌属共有15种，分别占3个系统中克隆数量的70%、80%、92%，不同电子供体的反应器中微生物群落分布相近.但从优势菌属的角度来看，甲醇和邻苯二甲酸氢钾为电子供体的污泥样本相似度较高，MeOH/KHP样本间存在4种相同的优势菌属，重叠率达46%；对比其他样本仅存在2种相同的优势菌属，Glc/MeOH及Glc/KHP样本间优势菌属的重叠率仅为14%及30%.
从反应系统的NO3-脱氮转化率看，C/N=4时不同电子供体的TN去除率在37.4%～57.9%之间，MeOH和KHP为电子供体时TN和NO3-的去除率同步进行，但Glc为电子供体的反应器NO3-的去除率比TN去除率多出18.9%，硝酸盐反硝化率较低.不同污泥样本克隆中检出的可进行反硝化行为的菌属包括Paracoccus denitrificans、Aromatoleum aromaticum、Candidatus Accumulibacter phosphatis、Paracoccus denitrificans、Thauera sp. MZ1T以及Thioalkalivibrio sp.、Mesorhizobium sp.，在Glc样本、MeOH样本和KHP样本中的占比分别为39%、46%、63%，Glc为电子供体时微生物群落中反硝化菌群的占比相对较低；污泥样本分析也表明MeOH/KHP样本间优势菌属重叠率高达46%.由此可见微生物群落的分布可以反映出反应器的运行效率和生化反应系统的差异性.
3 结 论
（1） 从总氮降解速率看，以葡萄糖和甲醇为电子供体，当C/N=4时，TN去除速率常数比以邻苯二甲酸氢钾为电子供体时高出71%，可能源于葡萄糖和甲醇的生物易降解性；而邻苯二甲酸氢钾不属于易生物降解碳源，成为TN去除速率的限制因素.当C/N=10时，葡萄糖、甲醇、邻苯二甲酸氢钾的TN去除速率常数没有明显差异，推测由于碳氮比较高，氮源底物同化作用较强，不同电子供体间未体现出反硝化差异. （2） 从硝酸盐氮的脱氮转化率看，当反应器HRT为12 h时，C/N=10时不同电子供体的TN和NO3-的去除基本同步，可能亦是受到氮源底物同化作用较强的影响.C/N=4时，葡萄糖和甲醇的TN去除动力学常数k均为0.96，但从转化后的NO3-的脱氮率看，甲醇和邻苯二甲酸氢钾作为电子供体时的NO3-和TN的去除率基本相同，脱氮率明显优于葡萄糖；葡萄糖作为电子供体的反应器中存在约18.9%的转化后的NO3-未能进行反硝化脱氮.
（3） 污泥样本中的微生物菌落检出情况可以反应出反应器的运行状况，3个反应器中厌氧菌群、硝化及反硝化菌群特征明显；Aromatoleum aromaticum、Candidatus Accumulibacter phosphatis 、Beijerinckia indica subsp.等菌属的存在反映出反应系统的底物磷过剩、厌氧产甲烷过程以及电子供体种类特征等特点.因此，从微生物群落分布特征可以对反应器运行状况作出定性的判断.
（4） 从反应系统硝酸盐氮的脱氮转化率看，C/N=4时MeOH和KHP为电子供体时TN和NO3-的硝酸盐反硝化率介于95%～100%，去除率基本同步；而Glc为电子供体的反应器中NO3-的去除率比TN去除率高了18.9%，可见Glc为电子供体的硝酸盐反硝化率较低.同时，Glc为电子供体时微生物群落中反硝化菌群的占比最低，而MeOH/KHP样本间优势菌属重叠率最高.由此可见，微生物群落的分布可以反映出反应器的运行效率和生化反应系统的差异性.
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Abstract：Glucose （Glu），methanol （MeOH） and potassium hydrogen phthalate （KHP） were in dividually used as electron donor for anaerobic denitrification of NO3-N and C/N ratio was respectively set as 4∶1 and 10∶1 electron donor for each.The experimental results show that Glu and MeOH have similar total nitrogen （TN） removal rates had which are higher than that of KHP under C/N ratias of both 4∶1 and 10∶1.The TN removal rates with Glu and MeOH as electron donors are higher by 71% than that with KHP at C/N of 4∶1，but the difference decreases to 7% at C/N of 10∶1.For the different electron donors，microbiological communities gave obvious characteristics in their in activated sludge systems，in which the electron donors corresponded to their in dividual advantage anaerobic，nitrifying and denitrifying bacteria，and reflected system difference.
Key words：electron donor； denitrification； biological nitrogen removal； microbial community
（责任编辑：郁 慧）
关键词：电子供体； 反硝化； 生物脱氮； 微生物群落
中图分类号： X 506 文献标志码： A 文章编号： 10005137（2016）01009409
0 前 言
化肥制造、燃料生产、肉类加工等工业排放的废水中一般均含有高浓度的氨氮、硝酸盐或亚硝酸盐，通常采用A/O或A2/O等工艺来对这类废水进行总氮的去除[1-2].采用A/O或A2/O工艺时，氨氮需要通过硝化、反硝化两阶段进行总氮的去除，这一过程需要消耗大量的溶解氧和碳源.因此，为了在脱氮过程中降低溶解氧的消耗和解决反硝化过程中碳源不足的问题，人们探索出同步硝化反硝化[3-4]、短程硝化反硝化[5-6]、厌氧氨氧化[7]等工艺方法，避免全程硝化反应以节省动力消耗，尤其是减少有机碳源的消耗，而提高污水中本身含有的碳源在反硝化过程中的利用是最为经济的方式.因此，提高有机碳源（电子供体）的利用效率已成为当今废水脱氮技术亟待解决的问题之一.很早就有研究发现，厌氧反应系统在一定条件下可以达到硝酸盐的良好去除[8-9]，当有适当碳源提供时，硝酸盐的反硝化脱氮反应可以顺利进行，实验数据显示在厌氧反应器中，当硝酸盐进水浓度为20～410 mg/L时脱氮效率可以达到89%～98%，有的情况下甚至可以达到硝酸盐的彻底去除.
在通常的生物脱氮过程中，除了提供一定的有机碳源作为电子供体之外，还需确保反应体系有一定的厌氧条件，即确保其溶解氧在一定的浓度之下.通常在厌氧体系中，往往会伴随着甲烷的产生.有人在研究UASB和MBR组成的硝化反硝化系统时，在UASB反应中观测到明显的，有机碳源被反硝化过程利用，从而降低了甲烷产量[5].进一步有研究证实，在厌氧反应体系中常常伴随着导致甲烷氧化的现象，即厌氧过程中产生的甲烷在硝酸盐氮存在的条件下可被氧化，并导致脱氮现象[10].从废水脱氮角度考虑，厌氧环境中甲烷氧化作为反硝化的电子供体，可在很大程度上解决碳源不足的问题.
通常生物反应体系可以通过适当的操作或控制实现所设定的缺氧条件，而选择何种碳源就成为反硝化脱氮的关键因素.本研究分别以甲醇、葡萄糖和邻苯二甲酸氢钾作为有机碳源，加入到硝酸盐为营养物质厌氧反应器中，在不同碳氮比的条件下建立厌氧反硝化体系，并在测定其反硝化反应效率的基础上，对微生物体系中微生物群落分布进行系统分析.同时借助分析反应系统中微生物群落组成的规律，判断反硝化系统中微生物对有机物及营养物质利用的状态.本研究拟通过反应器运行效果分析结合微生物群落状态的分析，解析厌氧条件下总氮去除的机理，并有利于在工程应用上采取有效的控制手段保持微生物体系的高效运行.
1 材料与方法
1.1 溶液制备
实验用水采用人工配置，在自来水中加入含有碳源、硝酸盐、磷营养元素及微量元素的配制溶液.实验溶液配制用水为MilliQ Integral水纯化系统制备的纯水.微量元素混合溶液组成（g/L）为：FeCl2·4H2O 1.5，NiCl2·6H2O 0.024，CoCl2·6H2O 0.19，CuCl2·2H2O 0.002，MnSO4·7H2O 0.1，Na2MoO4·2H2O 0.024，ZnCl2 0.07，H3BO3 0.006.试验用葡萄糖、邻苯二甲酸氢钾、甲醇、硝酸钠、磷酸二氢钾和碳酸氢钠等药剂均为分析纯，购自上海国药集团.
1.2 活性污泥驯化
活性污泥来源为上海龙华水质净化厂的二沉池污泥.在500 mL的摇瓶里采用葡萄糖为碳源进行培养和驯化，当污泥沉降性能达到SV30，上清液清澈，且对COD的降解效率稳定在70%以上后，将此活性污泥定量加入3个250 mL的锥形瓶里，分别采用葡萄糖、甲醇和邻苯二甲酸氢钾进行反硝化污泥的驯化.控制COD从400 mg/L 逐渐增加至1000 mg/L，NO3-N从20 mg/L逐步增加到100 mg/L.实验过程中C/N比为4和10，N/P比始终保持在5 ∶1.反应过程中摇瓶采用充氮气方式排除液体上方氧气并封口，将锥形瓶里的溶解氧控制在0.5～1.0 mg/L以下.反应中采用磁力搅拌器进行搅拌，保持污泥和溶液的良好混合状态，采用续批式运行，反应换水周期为24 h.当60 mg/L的NO3-N在12 h的反应时间内达到80%以上的去除率时，认为生物反硝化驯化完成.
1.3 反应装置运行
分别用葡萄糖、甲醇和邻苯二甲酸氢钾作为碳源，将驯化好的污泥分别放置在3个250 mL的锥形瓶内，并加入微量元素等其他所需营养元素进行反硝化实验.硝酸盐的生物降解实验中的3种碳源分别采用的C/N比为4和10.当NO3-N的初始浓度为60 mg/L时，分别以C6H12O6、CH3OH和C8H5KO4为碳源进行序批式反应，反应时间根据需要设定.实验中定时间取样，水样均经过0.22 m的水系膜过滤后进行测试分析.
反硝化动力学实验以C6H12O6、CH3OH和C8H5KO4为碳源，设置不同NO3-N初始浓度在30～210 mg/L之间进行反硝化实验，测试NO3-N在反应最初10 min内的浓度变化进行动力学研究.实验中定时间取样，水样经过0.22 m的水系膜过滤后进行测试分析. 1.4 分析方法
NO3-用DIONEX ICS5000离子色谱进行分析，所得结果再转化为NO3-N.COD参照《水和废水监测分析方法》（中国环境科学出版社，2002年，第四版）中重铬酸钾法.
在实验结束时，分别从以葡萄糖、甲醇、邻苯二甲酸氢钾为碳源的反应系统中提取稳定的活性污泥样本，低温密封保存在离心管中，分别标注为Glc（葡萄糖）样本，MeOH （甲醇）样本和KHP（邻苯二甲酸氢钾）样本.在24 h内送至上海捷瑞生物有限公司进行分子生物学分析.使用DNAzol试剂抽提微生物DNA以作为PCR反应的模板，测试分析采用的通用引物为细菌16Sr DNA：F （5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′）和R （5′CAKAAAGGAGGTGATCC3′）.
2 结果与讨论
2.1 有机碳源对总氮去除速率的影响
分别采用葡萄糖（Glc）、甲醇（MeOH）和邻苯二甲酸氢钾（KHP）作为有机碳源添加入含氮废水中，在C/N比分别为4和10进行的反硝化实验，其结果如图1所示.从图1可以看出，TN去除速率可以用分数级反应动力学r=-dCdt=kCα进行描述.该式经过积分可以得到TN浓度C与反应级数α、反应速率常数k和时间t的关系为：C=[C1-α0-kt（1-α）]11-α.相关动力学参数可以通过试差法得到，其结果如表1所示.
当C/N比为4时，无论以哪种有机物作为电子供体，其反硝化速率都较低.此时的反应级数为α=0.33，以葡萄糖和甲醇为电子供体时，其TN去除速率常数均为0.96 （mg·L-1）0.87·h-1，而以邻苯二甲酸氢钾为电子供体时，其常数为：0.56 （mg·L-1）0.87·h-1.即以葡萄糖和甲醇为碳源时，TN去除速率比以邻苯二甲酸氢钾时高出71%.
当C/N=10时，总氮去除速率明显提高，此时的反应级数提高到了0.83，以葡萄糖和甲醇为电子供体时，其TN去除速率常数均为0.62 （mg·L-1）0.87·h-1，以邻苯二甲酸氢钾为电子供体时，其常数为：0.58 （mg·L-1）0.87·h-1.此时，不同有机物作为电子供体时，他们对TN去除速率的效率较为接近.这一实验结果表明，当有机碳源充足时，有机物种类的影响不是主要的.而当C/N较小时，有机物种类对TN的去除速率影响较大.
当反应器HRT为12 h时，以葡萄糖、甲醇和邻苯二甲酸氢钾为电子供体的总氮及硝酸盐氮去除情况如图2所示.C/N=10时，葡萄糖、甲醇和邻苯二甲酸氢钾的总氮及硝酸盐氮去除率分别为95.2%、95.4%、99.7%和95.4%、100%、100%；当反应器HRT为12 h、C/N=4时，葡萄糖、甲醇和邻苯二甲酸氢钾的总氮及硝酸盐氮去除率分别为47.6%、57.9%、37.4%和66.5%、58.4%、40.2%.可见，C/N=10时不同电子供体的TN和NO3-的去除基本同步；C/N=4时甲醇和邻苯二甲酸氢钾则基本同步，但以葡萄糖为底物的反应器中的NO3-的去除率比TN去除率多出18.9%，表明葡萄糖为底物时NO3-虽然降解了，但并未被反硝化脱氮，这18.9%的转化后的NO3-可能以NO2-或NH4+的形式表现在TN中.因此，虽然从动力学角度看C/N=4时葡萄糖和甲醇的TN去除动力学常数k均为0.96，但从NO3-N反硝化转化率看，甲醇和邻苯二甲酸氢钾作为电子供体时的NO3-和TN的去除基本同步，脱氮效率明显高于葡萄糖；C/N=10时，可能源于同化作用时需要消耗更多的N源，NO3-和TN的去除在整个反应过程中同步进行，反应结束时去除率介于95%～100%，NO3-和TN同步消耗殆尽.推测由于碳氮比较高，底物氮源同化作用较强，在TN的去除上，不同的电子供体间没有显示出明显差异.
2.2 有机碳源微生物群落分布之间的关系
反应器中微生物样品A、B与C中的细菌基因组DNA抽提后进行PCR扩增，扩增产物经电泳分离纯化后克隆到PMD18T载体上.为了鉴定活性污泥的菌种组成，所有样品随机挑选了100个克隆测序.测序结果根据GenBank数据库进行BLAST比对（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）.
从表2的3个样本的测序分析结果可以看出，葡萄糖为碳源的活性污泥克隆样本中的微生物群落种类较为丰富，统计测序结果得出总共有31个相关菌种；甲醇为碳源的活性污泥克隆样本中检出不同菌属25种；邻苯二甲酸氢钾为碳源的活性污泥克隆样本中检出了不同菌属19种.Glc样本、MeOH样本、KHP样本的优势菌属占比分别如图3所示.
在Glc、MeOH及KHP的3个污泥克隆样本中Anaerolinea thermophile菌株的检出占比分别为10%、4%、8%，为典型的嗜热厌氧菌属；3个污泥克隆样本中菌株Rhodopirellula baltica SH1的检出占比分别为2%、8%、6%，为浮霉菌门的红小梨形菌属，是一种专性厌氧产氢菌[11].Thioalkalivibrio sp.K90mix在3个样本中的检出比分别为2%、2%、2%，该菌属为专性化能自养微生物，可产生亚硝酸还原酶，说明3个处于厌氧状态的反应器中均存在微生物的对NO3-的脱氮行为[12].此外，3个样本中均含有Paracoccus denitrificans、Aromatoleum aromaticum、Mesorhizobium sp.等各类反硝化菌属[13].表明3个序批式反应器厌氧状态良好，并且存在微生物的脱氮行为.3个样本中Alkaliphilus metalliredigens QYMF的占比分别为5%、8%、3%，表明有机物降解通过碱性无氧呼吸进行[14]，而无氧呼吸的特点是以无机氧化物为最终电子受体，如NO3-、SO42-、CO2等，从而也可判断出系统的反硝化行为. 在以MeOH和KHP为电子供体的污泥样本中，Thauera sp. MZ1T的占比分别达到25%和36%，Glc样本中仅为2%.Thauera sp. MZ1T已知可以以硝酸盐为电子受体，并以多种芳香族有机物为电子供体进行反硝化反应，使厌氧反应产生的部分有机物中间产物被反硝化反应利用，降低了有机物在厌氧环境中被转化为甲烷的总量[15].Glc样本中虽然Thauera sp. MZ1T不是优势菌属，但其Candidatus Accumulibacter phosphatis clade的占比最高，为29%；在MeOH样本及KHP样本中，Candidatus Accumulibacter phosphatis的占比也分别达到9%及22%，均为优势菌株.本实验配水中始终保持N ∶P为5 ∶1的比例，由于反应器处于良好的厌氧状态，氮磷的供给均为过量，已知Candidatus Accumulibacter phosphatis是反硝化除磷系统中的典型优势菌属，在厌氧条件在体内储存过量的磷酸盐，同时以硝酸盐为电子受体进行反硝化脱氮[16-17].因此，从微生物群落特点也可以判断出反应器底物中存在充分的氮磷营养，在3个不同有机底物的反应器内均积累了大量的厌氧反硝化除磷微生物.
从部分被检出的菌株的生长代谢特点，也可以分析了解其对反应器中有机物的降解的特点及基本降解途径.Pedobacter heparinus在MeOH样本及KHP样本中的占比均为6%，为优势菌属，但在Glc样本中未检出，该细菌是最先被分离鉴别的可以利用肝磷酯作为唯一碳源和氮源而生长的鞘脂杆菌科菌属，可以产生多种裂解酶，包括可以降解黏多糖的酶类[18]，有利于有机物及其中间产物的分解.在污泥样本MeOH中Aromatoleum aromaticum达7%，属优势菌株.该菌株是含有短链醇脱氢酶的反硝化细菌，可以对各种有机醇类进行脱氢氧化[19]，说明甲醇底物降解是通过甲醇脱氢氧化为不饱和烃甲醛的这一途径进行的.而在Glc、MeOH及KHP样本中Beijerinckia indica subsp.的检出占比分别为2%、4%、4%，Beijerinckia indica是典型的甲烷营养型菌属，甲烷营养型菌属通常被分为I型和II型.Beijerinckia indica为II型甲烷氧化菌，仅以甲烷、甲醇为唯一的碳源和能源进行生长，但也有研究发现这一菌属中存在兼性营养型甲烷氧化菌可以利用乙酸等基质[20].本研究中采用的3个反应器均处于隔绝空气状态，系统的微生物菌落结构也证明了反应器的厌氧环境良好，反应系统中的甲烷氧化菌氧化有机物的氧来源仅能依靠配水中的NO3-提供，因此可以判断甲烷氧化菌Beijerinckia indica通过利用硝酸盐中的氧将甲烷进行单加氧反应生成甲醇，再氧化为甲醛；然后甲醛可通过丝氨酸途径同化，或被氧化为甲酸后再矿化为二氧化碳[21-22].
另外，在反应系统中还检出一些特殊菌属，如Glc、MeOH样本中检出了Acidimicrobium ferrooxidans菌株，属于放线菌门酸微菌目的酸微菌属.嗜酸细菌通常以硫和亚铁营自养生活，可以以氢作为电子供体生长[23]，而A.ferrooxidans可在葡萄糖酵母提取物等底物中混合营养生长[24].在MeOH样本中占比4%的约氏黄杆菌Flavobacterium johnsoniae具有分泌内切酶进行催化水解的能力[25].此外，3个样本中分别检测出1%～3%的脱卤菌属Dehalococcoides sp.，是含有卤代有机物的底物中的常见菌属[26]，但其在厌氧脱氮反应系统中的功能有待研究.总体上看，污泥样本中的微生物菌落检出情况可以反应出反应器的运行状况，3个反应器中厌氧菌群、硝化及反硝化菌群特征明显；Aromatoleum aromaticum、Candidatus Accumulibacter phosphatis等菌属的存在也反映出底物磷过剩和底物种类的影响；Beijerinckia indica subsp.可以看出厌氧过程进行到了产甲烷过程.因此，从微生物群落分布特征可以对反应器运行状况作出定性的判断.
从底物电子供体分析，在3个样本中检出的相同菌属共有15种，分别占3个系统中克隆数量的70%、80%、92%，不同电子供体的反应器中微生物群落分布相近.但从优势菌属的角度来看，甲醇和邻苯二甲酸氢钾为电子供体的污泥样本相似度较高，MeOH/KHP样本间存在4种相同的优势菌属，重叠率达46%；对比其他样本仅存在2种相同的优势菌属，Glc/MeOH及Glc/KHP样本间优势菌属的重叠率仅为14%及30%.
从反应系统的NO3-脱氮转化率看，C/N=4时不同电子供体的TN去除率在37.4%～57.9%之间，MeOH和KHP为电子供体时TN和NO3-的去除率同步进行，但Glc为电子供体的反应器NO3-的去除率比TN去除率多出18.9%，硝酸盐反硝化率较低.不同污泥样本克隆中检出的可进行反硝化行为的菌属包括Paracoccus denitrificans、Aromatoleum aromaticum、Candidatus Accumulibacter phosphatis、Paracoccus denitrificans、Thauera sp. MZ1T以及Thioalkalivibrio sp.、Mesorhizobium sp.，在Glc样本、MeOH样本和KHP样本中的占比分别为39%、46%、63%，Glc为电子供体时微生物群落中反硝化菌群的占比相对较低；污泥样本分析也表明MeOH/KHP样本间优势菌属重叠率高达46%.由此可见微生物群落的分布可以反映出反应器的运行效率和生化反应系统的差异性.
3 结 论
（1） 从总氮降解速率看，以葡萄糖和甲醇为电子供体，当C/N=4时，TN去除速率常数比以邻苯二甲酸氢钾为电子供体时高出71%，可能源于葡萄糖和甲醇的生物易降解性；而邻苯二甲酸氢钾不属于易生物降解碳源，成为TN去除速率的限制因素.当C/N=10时，葡萄糖、甲醇、邻苯二甲酸氢钾的TN去除速率常数没有明显差异，推测由于碳氮比较高，氮源底物同化作用较强，不同电子供体间未体现出反硝化差异. （2） 从硝酸盐氮的脱氮转化率看，当反应器HRT为12 h时，C/N=10时不同电子供体的TN和NO3-的去除基本同步，可能亦是受到氮源底物同化作用较强的影响.C/N=4时，葡萄糖和甲醇的TN去除动力学常数k均为0.96，但从转化后的NO3-的脱氮率看，甲醇和邻苯二甲酸氢钾作为电子供体时的NO3-和TN的去除率基本相同，脱氮率明显优于葡萄糖；葡萄糖作为电子供体的反应器中存在约18.9%的转化后的NO3-未能进行反硝化脱氮.
（3） 污泥样本中的微生物菌落检出情况可以反应出反应器的运行状况，3个反应器中厌氧菌群、硝化及反硝化菌群特征明显；Aromatoleum aromaticum、Candidatus Accumulibacter phosphatis 、Beijerinckia indica subsp.等菌属的存在反映出反应系统的底物磷过剩、厌氧产甲烷过程以及电子供体种类特征等特点.因此，从微生物群落分布特征可以对反应器运行状况作出定性的判断.
（4） 从反应系统硝酸盐氮的脱氮转化率看，C/N=4时MeOH和KHP为电子供体时TN和NO3-的硝酸盐反硝化率介于95%～100%，去除率基本同步；而Glc为电子供体的反应器中NO3-的去除率比TN去除率高了18.9%，可见Glc为电子供体的硝酸盐反硝化率较低.同时，Glc为电子供体时微生物群落中反硝化菌群的占比最低，而MeOH/KHP样本间优势菌属重叠率最高.由此可见，微生物群落的分布可以反映出反应器的运行效率和生化反应系统的差异性.
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Abstract：Glucose （Glu），methanol （MeOH） and potassium hydrogen phthalate （KHP） were in dividually used as electron donor for anaerobic denitrification of NO3-N and C/N ratio was respectively set as 4∶1 and 10∶1 electron donor for each.The experimental results show that Glu and MeOH have similar total nitrogen （TN） removal rates had which are higher than that of KHP under C/N ratias of both 4∶1 and 10∶1.The TN removal rates with Glu and MeOH as electron donors are higher by 71% than that with KHP at C/N of 4∶1，but the difference decreases to 7% at C/N of 10∶1.For the different electron donors，microbiological communities gave obvious characteristics in their in activated sludge systems，in which the electron donors corresponded to their in dividual advantage anaerobic，nitrifying and denitrifying bacteria，and reflected system difference.
Key words：electron donor； denitrification； biological nitrogen removal； microbial community
（责任编辑：郁 慧）