论文部分内容阅读
【摘要】目的：调查贵阳地区孕妇人群脊髓性肌萎缩症（SMA）携带率，并对高风险的孕妇行产前基因诊断，防止SMA患儿的出生。方法：应用多重荧光定量PCR技术对524例孕妇的SMN1基因外显子7和8的拷贝数进行检测，筛查出SMA携带者，并计算携带者的频率。对携带者的配偶进行筛查，并为双方均为携带者的夫妇提供产前诊断。结果：在524例孕妇中，共检出SMA携带者12例，携带比例为1/44，检出率2.29%.，其中SMN1基因外显子7单一缺失的携带者2例（占16.7%），外显子7合并外显子8缺失携带者10例（占83.3%），未检测出同为SMA携带者的夫妇。曾经生育过SMA患儿的1对夫妇均为SMN1基因外显子7合并外显子8杂合缺失携带者。对高风险胎儿进行产前基因诊断，确诊为SMN1纯合缺失胎儿。结论：初步获得了贵阳地区孕妇人群SMA的携带率为1/44。SMA携带者筛查可为遗传咨询和产前诊断提供依据，对于优生优育、有效预防SMA胎儿的出生具有重要的临床意义。
【关键词】脊髓性肌萎缩症；携带者筛查；运动神经元存活基因；产前诊断
【中图分类号】R714.55 【文献标识码】A 【文章编号】2096-5249（2021）12-0191-02
脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy， SMA）是一种儿童致死性神经系统疾病，为常染色体隐性遗传[1]。SMA的人群发病率约为1/6000～1/10000，携带率为1/40～1/60[2]。SMA致病基因是位于5号染色体长臂l区3带（5q13）的运动神经元存活基因（survival motor neuron，SMN）。端粒侧的SMN1和中心粒侧的SMN2，是两个相邻的高度同源的SMN基因，两个基因序列之间仅有5个碱基的差异。主要功能基因为SMN1，修饰基因SMN2一定程度上可以缓解SMA的严重程度。SMA发生的分子基础是由于功能异常SMN1基因使脊髓前角α细胞变性所导致的[3]。多数SMA 病例（约为95 %）为SMN 1基因外显子7的纯合缺失，少数病例（约<5%）是由SMN1基因外显子7杂合缺失与SMN 1基因点突变复合杂合致 病[4-6]。因此，针对SMN1外显子7的拷贝数检测已成为目前筛查 SMA携带者的常用方式。
由于SMA预后不良，目前尚无特效治疗方法，通过遗传筛查以及产前诊断来防止SMA患儿的出生是预防本病最有效的方法。迄今，未见贵州地区人群SMA携带率的文献报道。本研究中，我们应用PCR法对产检孕妇进行SMN1基因筛查，了解本地孕妇人群SMA的携带率，并对高风险的孕妇行产前基因检测，防止SMA 患儿的出生。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选取2018年1月至2018年12月于贵州省人民医院妇进行常规产检的表型正常的孕妇524例，孕妇年龄20～50（28.1±2）岁，孕周10～22（16±3.2）周。其中具有SMA阳性家族史的孕妇1例，33岁，G2P1，曾生育SMA患儿1例。所有自愿筛查对象均需签署临床研究知情同意书。
纳入标准：健康孕妇人群、不良孕史人群以及高危孕 产妇。
排除标准：无。
1.2 方法
（1）样本采集。釆集受检者外周静脉血2 mL，EDTA-K2抗凝，置于2～8 ℃冷藏条件下保存，并在1周内完成检测。
（1）DNA提取。使用NP986-C核酸提取系统（西安天隆有限公司）及配套试剂提取外周血DNA，采用NanoDrop one超微量生物检测仪（基因有限公司）对DNA的浓度进行检测。
（1）基因检测。运动神经元存活基因1（SMN1）外显子缺失检测试剂盒（荧光定量PCR法）检测试剂由上海五色石医学研究有限公司提供，对SMN1基因外显子7和外显子8拷贝数进行检测。操作按试剂盒说明书进行，PCR扩增条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，58 ℃退火延伸60 s，共40个循环；FAM通道及VIC通道用于信号采集。
1.3 结果判断
应用比较阈值法（△△Ct法或2-△△Ct）计算受检者样本中SMN1基因外显子7、8的拷贝数。待测样本中，若外显子7反应的△△Ct >0.8或无扩增信号；外显子8反应的△△Ct >1.5或无扩增信号，即为SMN1基因外显子7、8纯合缺失。若外显子7反应的△△Ct介于±0.45之间；外显子8反应的△△Ct 介于±0.45之间，即为SMN1基因外显子7、8杂合缺失。
产前诊断：若孕妇检测为SMA携带者，则对其配偶进行携带者筛查；若夫妇双方均为SMA携带者，经知情同意后于孕16～22周，经腹壁行羊膜腔穿刺術，在B超引导下使用一次性无菌注射器，缓慢抽取羊水10 mL，按上述方法检测胎儿SMN1基因。
2 结果
2.1 样本SMN1基因检测结果
所有样本均检测成功，根据结果判读标准获得SMN1基因外显子7、8缺失突变的基因型。
2.2 524例产检孕妇SMA携带率
在524例产检孕妇中检出12例孕妇为SMA携带者，携带率为1/44，检出率2.29% ，其中SMN1基因外显子7单一缺失的携带者2例（占16.7%），外显子7合并外显子8缺失携带者10例（占83.3%）。进一步对携带者的配偶进行SMA基因检测，检测出同为SMA携带者的夫妇0对。
2.3 SMA产前诊断
对曾经生育过SMA患儿的1对夫妇进行检测，明确均为SMN1基因外显子7合并外显子8杂合缺失携带者。孕 18 周时行羊水穿刺，胎儿SMN1基因产前诊断结果为外显子7合并外显子8纯合缺失，确诊为SMA胎儿。根据孕妇夫妇意愿选择终止妊娠。
3 讨论
脊髓性肌萎缩症依据病情严重程度以及发病的年龄可将SMA分为四种临床型[7]，其中约有80%以上的患儿均为I或II型。尽管已有针对 SMA 的治疗药物出现，但由于其昂贵的治疗费用，使其不能普遍使用。现阶段，科学的产前筛查比患病后的治疗，更具有卫生经济学意义。因此，通过携带者筛查和产前诊断，避免患儿的出生，仍是行之有效的SMA预防 手段。 在本研究中，我們应用荧光定量PCR技术对523名贵阳地区的孕妇人群进行了SMN1基因缺失携带者的筛查，结果显示贵阳地区SMA 携带者频率为 1/44。其中以SMA1基因外显子7和外显子8共同缺失为最多，占所有携带者的83.3%，外显子7单一缺失仅占16.7%，与国内文献报道结果一致。本组孕妇中检出为外显子8单一缺失2例。由于外显子8位于非编码区，仅有外显子8缺失时是不致病的。本研究采用的检测方法能检出95%以上的SMN1基因缺失型突变，约有4%的SMA携带者为“2+0”类型[8]，即1条5染色体上有两个SMN1基因，另一条5号染色体上的SMN1基因存在外显子7缺失的情形，本研究的检测方法不能直接检测出“2+0”类型携带者，需要依据确诊的SMA患者父母的SMN1基因拷贝数结合家族史进行测序验证。
本研究初步确定了贵阳地区SMA 携带者的频率，同时，对1对SMA携带者夫妇进行产前诊断，避免 1 例SMA患儿的出生。本研究由于未对 SMN2 基因拷贝数以及 SMN1 基因少见突变类型深入研究，在解读筛查结果时，需要告知受检者本研究的检测方法可能存在漏检的情况。临床应用时还要结合临床表型，确定是否需要对少见SMN1突变类型进行检测，防止漏诊。
参考文献
[1] Acsadi G，Li X，Murphy KJ，et al.Alpha-synuclein loss in spinal muscular atrophy[J].J Mol Neurosci，2011，43（3）：275-283.
[2] Verhaart IEC，Robertson A，Wi1son IJ，et a1.Preva1ence， incidence and carrier frequency of 5q-1inked spina1 muscu1ar atroph-a 1iterature review[J].Orphanet J Rare Dis，2017，12（1）：124-130.
[3] Ruhno c，Mc Govem VL，Avenarius MR，et a1.Complete quencing of the SMN2 gene in SMA patients detects SMN gene deletion junctions and variants in SMN2 that modify the SMA phenotype[J].Hum Genet，2019，138（3）：241-256.
[4] Arnold WD，Kassar D，Kisse1 JT.Spina1 muscu1ar atrophy： diagnosis and management in a new therapeutic era[J].Musc1e Nerve，2015，51（2）：157-167.
[5] Wirth B.An update of the mutation spectrum of the survival motor neuron gene （SMN1） in autosomal recessive spinal muscular atrophy （SMA）[J].Hum Mutat，2000（15）：228-237.
[6] Liu WL，Li F，He ZX，et al.Molecular analysis of the SMN gene mutations in spinal muscular atrophy patients in China[J]. Genet Mol Res，2013，（12）：3598-3604.
[7] Wang N，He J，Chen WJ.The research progress of clinical diagnosis of spinal muscular atrophy[J].Chin J Contemp Neurol Neurosurg，2012，（12）：252-256.
[8] Zhang J，Wang Y，Ma D，et a1.Carrier screening and prenatal diagnosis for Spinal Muscular Atrophy in 13069 Chinese pregnant women[J].The Journal of Molecular Diagnostics，2020（3）：1525-1578.
【关键词】脊髓性肌萎缩症；携带者筛查；运动神经元存活基因；产前诊断
【中图分类号】R714.55 【文献标识码】A 【文章编号】2096-5249（2021）12-0191-02
脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy， SMA）是一种儿童致死性神经系统疾病，为常染色体隐性遗传[1]。SMA的人群发病率约为1/6000～1/10000，携带率为1/40～1/60[2]。SMA致病基因是位于5号染色体长臂l区3带（5q13）的运动神经元存活基因（survival motor neuron，SMN）。端粒侧的SMN1和中心粒侧的SMN2，是两个相邻的高度同源的SMN基因，两个基因序列之间仅有5个碱基的差异。主要功能基因为SMN1，修饰基因SMN2一定程度上可以缓解SMA的严重程度。SMA发生的分子基础是由于功能异常SMN1基因使脊髓前角α细胞变性所导致的[3]。多数SMA 病例（约为95 %）为SMN 1基因外显子7的纯合缺失，少数病例（约<5%）是由SMN1基因外显子7杂合缺失与SMN 1基因点突变复合杂合致 病[4-6]。因此，针对SMN1外显子7的拷贝数检测已成为目前筛查 SMA携带者的常用方式。
由于SMA预后不良，目前尚无特效治疗方法，通过遗传筛查以及产前诊断来防止SMA患儿的出生是预防本病最有效的方法。迄今，未见贵州地区人群SMA携带率的文献报道。本研究中，我们应用PCR法对产检孕妇进行SMN1基因筛查，了解本地孕妇人群SMA的携带率，并对高风险的孕妇行产前基因检测，防止SMA 患儿的出生。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选取2018年1月至2018年12月于贵州省人民医院妇进行常规产检的表型正常的孕妇524例，孕妇年龄20～50（28.1±2）岁，孕周10～22（16±3.2）周。其中具有SMA阳性家族史的孕妇1例，33岁，G2P1，曾生育SMA患儿1例。所有自愿筛查对象均需签署临床研究知情同意书。
纳入标准：健康孕妇人群、不良孕史人群以及高危孕 产妇。
排除标准：无。
1.2 方法
（1）样本采集。釆集受检者外周静脉血2 mL，EDTA-K2抗凝，置于2～8 ℃冷藏条件下保存，并在1周内完成检测。
（1）DNA提取。使用NP986-C核酸提取系统（西安天隆有限公司）及配套试剂提取外周血DNA，采用NanoDrop one超微量生物检测仪（基因有限公司）对DNA的浓度进行检测。
（1）基因检测。运动神经元存活基因1（SMN1）外显子缺失检测试剂盒（荧光定量PCR法）检测试剂由上海五色石医学研究有限公司提供，对SMN1基因外显子7和外显子8拷贝数进行检测。操作按试剂盒说明书进行，PCR扩增条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，58 ℃退火延伸60 s，共40个循环；FAM通道及VIC通道用于信号采集。
1.3 结果判断
应用比较阈值法（△△Ct法或2-△△Ct）计算受检者样本中SMN1基因外显子7、8的拷贝数。待测样本中，若外显子7反应的△△Ct >0.8或无扩增信号；外显子8反应的△△Ct >1.5或无扩增信号，即为SMN1基因外显子7、8纯合缺失。若外显子7反应的△△Ct介于±0.45之间；外显子8反应的△△Ct 介于±0.45之间，即为SMN1基因外显子7、8杂合缺失。
产前诊断：若孕妇检测为SMA携带者，则对其配偶进行携带者筛查；若夫妇双方均为SMA携带者，经知情同意后于孕16～22周，经腹壁行羊膜腔穿刺術，在B超引导下使用一次性无菌注射器，缓慢抽取羊水10 mL，按上述方法检测胎儿SMN1基因。
2 结果
2.1 样本SMN1基因检测结果
所有样本均检测成功，根据结果判读标准获得SMN1基因外显子7、8缺失突变的基因型。
2.2 524例产检孕妇SMA携带率
在524例产检孕妇中检出12例孕妇为SMA携带者，携带率为1/44，检出率2.29% ，其中SMN1基因外显子7单一缺失的携带者2例（占16.7%），外显子7合并外显子8缺失携带者10例（占83.3%）。进一步对携带者的配偶进行SMA基因检测，检测出同为SMA携带者的夫妇0对。
2.3 SMA产前诊断
对曾经生育过SMA患儿的1对夫妇进行检测，明确均为SMN1基因外显子7合并外显子8杂合缺失携带者。孕 18 周时行羊水穿刺，胎儿SMN1基因产前诊断结果为外显子7合并外显子8纯合缺失，确诊为SMA胎儿。根据孕妇夫妇意愿选择终止妊娠。
3 讨论
脊髓性肌萎缩症依据病情严重程度以及发病的年龄可将SMA分为四种临床型[7]，其中约有80%以上的患儿均为I或II型。尽管已有针对 SMA 的治疗药物出现，但由于其昂贵的治疗费用，使其不能普遍使用。现阶段，科学的产前筛查比患病后的治疗，更具有卫生经济学意义。因此，通过携带者筛查和产前诊断，避免患儿的出生，仍是行之有效的SMA预防 手段。 在本研究中，我們应用荧光定量PCR技术对523名贵阳地区的孕妇人群进行了SMN1基因缺失携带者的筛查，结果显示贵阳地区SMA 携带者频率为 1/44。其中以SMA1基因外显子7和外显子8共同缺失为最多，占所有携带者的83.3%，外显子7单一缺失仅占16.7%，与国内文献报道结果一致。本组孕妇中检出为外显子8单一缺失2例。由于外显子8位于非编码区，仅有外显子8缺失时是不致病的。本研究采用的检测方法能检出95%以上的SMN1基因缺失型突变，约有4%的SMA携带者为“2+0”类型[8]，即1条5染色体上有两个SMN1基因，另一条5号染色体上的SMN1基因存在外显子7缺失的情形，本研究的检测方法不能直接检测出“2+0”类型携带者，需要依据确诊的SMA患者父母的SMN1基因拷贝数结合家族史进行测序验证。
本研究初步确定了贵阳地区SMA 携带者的频率，同时，对1对SMA携带者夫妇进行产前诊断，避免 1 例SMA患儿的出生。本研究由于未对 SMN2 基因拷贝数以及 SMN1 基因少见突变类型深入研究，在解读筛查结果时，需要告知受检者本研究的检测方法可能存在漏检的情况。临床应用时还要结合临床表型，确定是否需要对少见SMN1突变类型进行检测，防止漏诊。
参考文献
[1] Acsadi G，Li X，Murphy KJ，et al.Alpha-synuclein loss in spinal muscular atrophy[J].J Mol Neurosci，2011，43（3）：275-283.
[2] Verhaart IEC，Robertson A，Wi1son IJ，et a1.Preva1ence， incidence and carrier frequency of 5q-1inked spina1 muscu1ar atroph-a 1iterature review[J].Orphanet J Rare Dis，2017，12（1）：124-130.
[3] Ruhno c，Mc Govem VL，Avenarius MR，et a1.Complete quencing of the SMN2 gene in SMA patients detects SMN gene deletion junctions and variants in SMN2 that modify the SMA phenotype[J].Hum Genet，2019，138（3）：241-256.
[4] Arnold WD，Kassar D，Kisse1 JT.Spina1 muscu1ar atrophy： diagnosis and management in a new therapeutic era[J].Musc1e Nerve，2015，51（2）：157-167.
[5] Wirth B.An update of the mutation spectrum of the survival motor neuron gene （SMN1） in autosomal recessive spinal muscular atrophy （SMA）[J].Hum Mutat，2000（15）：228-237.
[6] Liu WL，Li F，He ZX，et al.Molecular analysis of the SMN gene mutations in spinal muscular atrophy patients in China[J]. Genet Mol Res，2013，（12）：3598-3604.
[7] Wang N，He J，Chen WJ.The research progress of clinical diagnosis of spinal muscular atrophy[J].Chin J Contemp Neurol Neurosurg，2012，（12）：252-256.
[8] Zhang J，Wang Y，Ma D，et a1.Carrier screening and prenatal diagnosis for Spinal Muscular Atrophy in 13069 Chinese pregnant women[J].The Journal of Molecular Diagnostics，2020（3）：1525-1578.