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摘 要：为验证Pall Supor EBV过滤器（0.2 μm过滤精度）用于20%人血白蛋白注射剂达到除菌过滤的目的，在少量工艺流体中接种缺陷假单胞菌（B. diminuta）ATCC 19146TM后加入循环的20%人血白蛋白注射剂中。挑战溶液在最差工艺条件下通过待测过滤器，挑战水平应≥1.0×107 CFU/cm2有效过滤面积（CFU为菌落形成单位），分析滤出液是否含有缺陷假单胞菌。结果发现，滤出液不含有缺陷假单胞菌。得出的结论为：Pall Supor EBV过滤器（0.2 μm过滤精度）适用于20%人血白蛋白注射剂的除菌过滤。
关键词：人血白蛋白;EBV过滤器;除菌过滤;验证
20%人血白蛋白注射剂是非最终灭菌的无菌生物制品，其中最终灌装生产工艺需要使用0.2 μm过滤精度的除菌过滤器进行除菌过滤，以达到无菌的質量标准。本次试验采用的方法是：少量工艺流体中接种缺陷假单胞菌（Brevundimonas diminuta，B. diminuta）ATCC 19146TM后加入循环的20%人血白蛋白注射剂中。挑战溶液在最差工艺条件下通过待测过滤器，挑战水平应≥1.0×107 CFU/cm2有效过滤面积（CFU为菌落形成单位），分析滤出液是否含有缺陷假单胞菌。本试验旨在验证Pall Supor EBV过滤器 （0.2 μm过滤精度）用于20%人血白蛋白注射剂的除菌过滤效果。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
白蛋白注射液（质量分数为20%，广西冠峰生物制品有限公司），缺陷假单胞菌（B. diminuta）ATCC 19146TM （PW 081815，美国菌种保藏中心）。
1.1.2 主要仪器
除菌过滤器：0.2 μm过滤精度的Supor EBV滤膜（FTKEBV，美国Pall公司），0.45 μm过滤精度的Supor 450滤膜（型号60173，美国Pall公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 微生物准备和挑战用菌悬液
缺陷假单胞菌事先通过大规模培养至稳定期，菌体 （PW 081815）以冷冻状态保存，使用前制备成挑战用菌悬液。由于工艺流体对缺陷假单胞菌具有非杀菌性作用，将缺陷假单胞菌以3.1×107 CFU/mL的细菌浓度悬浮于少量的20%人血白蛋白注射剂中，然后加入循环的20%人血白蛋白注射剂中（约0.5 mL/min）挑战300 min，以达到适宜的挑战浓度。
1.2.2 仪器准备
（1）采用Pall进行挑战。待测滤膜与工艺过滤器（ABIEBV7PH4）所含的滤膜具有相同材质，在125 ℃下高压灭菌60 min。然后将滤膜安装在适当的过滤器夹持器中，有效过滤面积为13.8 cm2。每个夹持器安装一个待测滤膜或对照滤膜。为确认滤膜的过滤精度及完整性，使用前对每个过滤器进行泡点测试。
（2）为了确认缺陷假单胞菌的单分散性以及是否能够透过0.45 μm过滤精度滤膜，用Pall 0.45 μm过滤精度的Supor 450滤膜（60173）作为对照。
（3）用一定量的菌悬液挑战待测过滤器，每个过滤器的最终挑战水平应大于1.0×107 CFU/cm2有效过滤面积。将接种后的工艺流体逐渐加入循环通过待测和对照过滤器的工艺流体中。
（4）挑战试验操作参数。验证的首要目的是证明20%人血白蛋白注射剂在模拟实际生产工艺的挑战条件下不会影响Pall 0.2 μm过滤精度的Supor EBV滤膜对缺陷假单胞菌的完全截留[1]。为达到该目的，在模拟最恶劣工艺参数的试验条件下，将工艺流体循环通过待测过滤器和对照过滤器，同时将缺陷假单胞菌悬浮在少量工艺流体中，以大约0.5 mL/min的速度加入循环系统。
（5）在装有待测滤膜的夹持器下游，无菌连接一个装有Pall 0.2 μm过滤精度的Supor 200截留滤膜（66549）的夹持器。
（6）用悬浮于无菌20%人血白蛋白注射剂中的缺陷假单胞菌进行挑战。通过待测过滤器上下游的压力表来监测压差。挑战结束后，用3 000 mL无菌水冲洗截留过滤器，然后取出截留滤膜，置于大豆胰酶琼脂（TSA）平板上培养。
（7）挑战前和挑战后分别从菌悬液中取样检测活菌浓度，采用最低的菌浓度计算挑战浓度。
（8）平板均在（30±2）℃下培养至少7天。挑战后需对待测过滤器进行泡点测试。
2 结果与分析
2.1 工艺和试验参数
根据生产工艺，挑战试验在15～16 psi（0.10～0.11 MPa）下维持122 min、在29.0～30.5 psi（0.20～0.21 MPa）下维持10 min，其余时间低速循环，压差维持在7～9 psi（0.05～0.06 MPa）。
2.2 挑战前后的完整性测试数据
挑战前后的完整性测试数据如表1所示。
2.3 缺陷假单胞菌挑战用量
缺陷假单胞菌挑战用量如表2所示。
总挑战菌数（CFU）=较低的挑战菌浓度（CFU/mL）×菌悬液用量（mL）（1）
挑战浓度（CFU/mL）=总挑战菌数（CFU）/总批量（mL）（2）
2.4 待测过滤器和对照过滤器的挑战参数及细菌截留数据
待测过滤器和对照过滤器的挑战参数及细菌截留数据如表3所示。
总挑战菌数（CFU）=挑战浓度（CFU/mL）×批量（mL）（3）
挑战水平（CFU/cm2）=总挑战菌数（CFU）/有效过滤面积（EFA）（4）
截留量=总挑战菌数/总透过菌数（5）
Pall 0.2 μm过滤精度的Supor EBV除菌级滤膜（FTKEBV）截留了100%的挑战用微生物，表明在本研究所述的最恶劣试验条件下，该类滤膜可以完全截留缺陷假单胞菌。作为对照，0.45 μm过滤精度的Pall Supor 450对照滤膜（60173）允许缺陷假单胞菌透过到滤出液中，符合细菌截留试验的接受标准。
2.5 细菌挑战结果
在细菌挑战阶段，压差变化范围在7.0～30.5 psi，流速变化范围在10～54 mL/min。
2.6 接受标准
验证试验符合所有接受标准，如表4所示。
3 结语
Pall 0.2 μm过滤精度的Supor EBV除菌级过滤器可完全截留悬浮于20%人血白蛋白注射剂中的缺陷假单胞菌，挑战水平不低于8.7×107 CFU/cm2有效过滤面积。用20%人血白蛋白注射剂模拟生产工艺中的压差、时间和批量进行细菌挑战。根据试验结果，Pall Supor EBV除菌级过滤器在本试验所述的参数下，适用于20%人血白蛋白注射剂的除菌过滤。
[参考文献]
[1]MARTIN J.PDA technical report No.26“Sterilizing Filtration of Liquids”[EB/OL].（2007-06-13）[2021-02-20].https：//www.docin.com/p-566612727.html.
关键词：人血白蛋白;EBV过滤器;除菌过滤;验证
20%人血白蛋白注射剂是非最终灭菌的无菌生物制品，其中最终灌装生产工艺需要使用0.2 μm过滤精度的除菌过滤器进行除菌过滤，以达到无菌的質量标准。本次试验采用的方法是：少量工艺流体中接种缺陷假单胞菌（Brevundimonas diminuta，B. diminuta）ATCC 19146TM后加入循环的20%人血白蛋白注射剂中。挑战溶液在最差工艺条件下通过待测过滤器，挑战水平应≥1.0×107 CFU/cm2有效过滤面积（CFU为菌落形成单位），分析滤出液是否含有缺陷假单胞菌。本试验旨在验证Pall Supor EBV过滤器 （0.2 μm过滤精度）用于20%人血白蛋白注射剂的除菌过滤效果。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
白蛋白注射液（质量分数为20%，广西冠峰生物制品有限公司），缺陷假单胞菌（B. diminuta）ATCC 19146TM （PW 081815，美国菌种保藏中心）。
1.1.2 主要仪器
除菌过滤器：0.2 μm过滤精度的Supor EBV滤膜（FTKEBV，美国Pall公司），0.45 μm过滤精度的Supor 450滤膜（型号60173，美国Pall公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 微生物准备和挑战用菌悬液
缺陷假单胞菌事先通过大规模培养至稳定期，菌体 （PW 081815）以冷冻状态保存，使用前制备成挑战用菌悬液。由于工艺流体对缺陷假单胞菌具有非杀菌性作用，将缺陷假单胞菌以3.1×107 CFU/mL的细菌浓度悬浮于少量的20%人血白蛋白注射剂中，然后加入循环的20%人血白蛋白注射剂中（约0.5 mL/min）挑战300 min，以达到适宜的挑战浓度。
1.2.2 仪器准备
（1）采用Pall进行挑战。待测滤膜与工艺过滤器（ABIEBV7PH4）所含的滤膜具有相同材质，在125 ℃下高压灭菌60 min。然后将滤膜安装在适当的过滤器夹持器中，有效过滤面积为13.8 cm2。每个夹持器安装一个待测滤膜或对照滤膜。为确认滤膜的过滤精度及完整性，使用前对每个过滤器进行泡点测试。
（2）为了确认缺陷假单胞菌的单分散性以及是否能够透过0.45 μm过滤精度滤膜，用Pall 0.45 μm过滤精度的Supor 450滤膜（60173）作为对照。
（3）用一定量的菌悬液挑战待测过滤器，每个过滤器的最终挑战水平应大于1.0×107 CFU/cm2有效过滤面积。将接种后的工艺流体逐渐加入循环通过待测和对照过滤器的工艺流体中。
（4）挑战试验操作参数。验证的首要目的是证明20%人血白蛋白注射剂在模拟实际生产工艺的挑战条件下不会影响Pall 0.2 μm过滤精度的Supor EBV滤膜对缺陷假单胞菌的完全截留[1]。为达到该目的，在模拟最恶劣工艺参数的试验条件下，将工艺流体循环通过待测过滤器和对照过滤器，同时将缺陷假单胞菌悬浮在少量工艺流体中，以大约0.5 mL/min的速度加入循环系统。
（5）在装有待测滤膜的夹持器下游，无菌连接一个装有Pall 0.2 μm过滤精度的Supor 200截留滤膜（66549）的夹持器。
（6）用悬浮于无菌20%人血白蛋白注射剂中的缺陷假单胞菌进行挑战。通过待测过滤器上下游的压力表来监测压差。挑战结束后，用3 000 mL无菌水冲洗截留过滤器，然后取出截留滤膜，置于大豆胰酶琼脂（TSA）平板上培养。
（7）挑战前和挑战后分别从菌悬液中取样检测活菌浓度，采用最低的菌浓度计算挑战浓度。
（8）平板均在（30±2）℃下培养至少7天。挑战后需对待测过滤器进行泡点测试。
2 结果与分析
2.1 工艺和试验参数
根据生产工艺，挑战试验在15～16 psi（0.10～0.11 MPa）下维持122 min、在29.0～30.5 psi（0.20～0.21 MPa）下维持10 min，其余时间低速循环，压差维持在7～9 psi（0.05～0.06 MPa）。
2.2 挑战前后的完整性测试数据
挑战前后的完整性测试数据如表1所示。
2.3 缺陷假单胞菌挑战用量
缺陷假单胞菌挑战用量如表2所示。
总挑战菌数（CFU）=较低的挑战菌浓度（CFU/mL）×菌悬液用量（mL）（1）
挑战浓度（CFU/mL）=总挑战菌数（CFU）/总批量（mL）（2）
2.4 待测过滤器和对照过滤器的挑战参数及细菌截留数据
待测过滤器和对照过滤器的挑战参数及细菌截留数据如表3所示。
总挑战菌数（CFU）=挑战浓度（CFU/mL）×批量（mL）（3）
挑战水平（CFU/cm2）=总挑战菌数（CFU）/有效过滤面积（EFA）（4）
截留量=总挑战菌数/总透过菌数（5）
Pall 0.2 μm过滤精度的Supor EBV除菌级滤膜（FTKEBV）截留了100%的挑战用微生物，表明在本研究所述的最恶劣试验条件下，该类滤膜可以完全截留缺陷假单胞菌。作为对照，0.45 μm过滤精度的Pall Supor 450对照滤膜（60173）允许缺陷假单胞菌透过到滤出液中，符合细菌截留试验的接受标准。
2.5 细菌挑战结果
在细菌挑战阶段，压差变化范围在7.0～30.5 psi，流速变化范围在10～54 mL/min。
2.6 接受标准
验证试验符合所有接受标准，如表4所示。
3 结语
Pall 0.2 μm过滤精度的Supor EBV除菌级过滤器可完全截留悬浮于20%人血白蛋白注射剂中的缺陷假单胞菌，挑战水平不低于8.7×107 CFU/cm2有效过滤面积。用20%人血白蛋白注射剂模拟生产工艺中的压差、时间和批量进行细菌挑战。根据试验结果，Pall Supor EBV除菌级过滤器在本试验所述的参数下，适用于20%人血白蛋白注射剂的除菌过滤。
[参考文献]
[1]MARTIN J.PDA technical report No.26“Sterilizing Filtration of Liquids”[EB/OL].（2007-06-13）[2021-02-20].https：//www.docin.com/p-566612727.html.