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[摘 要] 近年来，随着国际上DNA条形码技术的发展，中国也越来越多的将DNA条形码技术应用到植物及中药材的鉴定及相关研究中，然而此技术在畜牧产品中的应用却还少见报道。本文综述了DNA条形码技术的原理、方法流程及其在动物研究中的应用，并对DNA条形码在畜牧产品中的应用前景进行展望。
[关键词] DNA条形码 COI 畜牧产品 前景
[中图分类号] Q819 [文献标识码] A [文章编号] 1003-1650 （2014）01-0252-02
近年来，DNA条形码技术受到了国际和国内的高度关注，并在动植物的鉴定领域得到了广泛应用。DNA条形码技术首先是由Tautz[1]等在2002年提出，并将其应用于生物分类系统，Hebert等[2，3]在2003年首次提出DNA条形码（DNA Barcoding）概念，并将其用于快速鉴定物种的标记物。到目前为止，国际上已经建立了包括生命条码联合会（Consortium forthe Barcode of Life， CBOL，http：// w ww.barcodeoflife.org），生命条码数据库（Barcode of Life Datasystems， BOLD，http：//www.boldsystems.org），以及国际生命条码计划（International Barcode of Life， iBOL，http：//www.ibol.org）在内的3个大型资源网站，吸引了50多个国家的投资者及合作组织。这些生命条码组织的成立，进一步推动了DNA条形码技术的发展。近年来，中国本土也形成了很多包括植物、动物及中药材在内的生物DNA条形码数据库，为物种鉴定及生物系统发育研究的发展提供了有力的基因证据。
一、DNA条形码技术的原理
条形码技术是一种通过对条形码进行电子扫描，从而实现对信息进行快速、准确的自动识别方法，目前已广泛应用与商品零售业[4]。DNA条形码与之类似，即利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定及其相关研究。DNA序列是由A、T、G、C 4种碱基组成，不同的碱基数目分别以不同的顺序进行排列组合就会有足够多数目的基因序列，从而包括所有物种的基因型[5，6]。
二、DNA条形码操作的方法流程
1.样品处理及DNA提取 首先对样品进行液氮冷冻及酒精消毒等处理工作。其次是进行DNA提取，DNA提取方法一般包括破碎细胞壁并释放DNA，分离DNA，纯化DNA，DNA浓缩、沉淀与洗涤等基本步骤[7]。目前常用的DNA提取方法有CTAB[8]法，高盐低PH[9]法，SDS[10]法以及试剂盒提取法等。对于植物样品，一般选择CTAB法 [11]，对于动物样品，一般采用SDS（十二烷基硫酸钠）原理提取DNA [12]。随着近年来DNA提取试剂盒的问世，试剂盒法已经广泛用于动植物DNA的提取。
2.PCR扩增
PCR（聚合酶链式反应）扩增就是使提取出的样品DNA在PCR扩增仪内进行反应，以达到DNA的数量成指数增长的效果。对于植物PCR扩增，目前国内一般采用叶绿体基因[13，4]和核基因[15]片段为目的基因。对于动物的PCR扩增，国内应用最多的动物条形码是COI基因。另外，线粒体基因以及核基因也越来越多的被用于动物研究中。
3.PCR产物检测及测序
目前，一般采取琼脂糖凝胶电泳方法检测 PCR产物，采用Sanger双向测序的方法。随着高通量测序技术的发展，国内的测序技术也在进一步提高。
4.获得DNA条形码 将测序返回的结果利用Choromas软件查看峰图质量，ContingExpress软件进行双向序列拼接，Bioedit软件进行序列编辑，最终获得DNA条形码。
三、DNA条形码技术在动物研究中的应用
1.DNA条形码在昆虫中的应用
早在21世纪初，我国学者就已经利用线粒体COI基因对线虫、蛔虫、水蚤和吸虫等线形动物进行了序列差异研究。之后Hajibabaei M等基于COI基因对鳞翅目521种昆虫进行了序列分析，发现对其物种鉴别效率可以达到97.9%。潘程莹等对7种蝗虫的线粒体COI基因进行了研究，发现基于COI基因可以实现对蝗虫的鉴别，并揭示了蝗虫的系统进化历程。这表明DNA条形码在昆虫类的鉴别研究中已经相当成熟。
2.DNA条形码在鱼类中的应用
DNA条形码在鱼类中的开发和应用也较为广泛。Ward等对澳大利亚207种海洋鱼类进行分析，发现所有物种在COI基因上都有一定差异，通过系统发育关系的构建，发现COI基因可作为海洋鱼类DNA条形码的标准序列。此外，Zemlak等用COI基因研究印度洋沿岸35种鱼的229个样本发现，南非和澳大利亚海域的同种鱼类存在很大的差异，指出南非和澳大利亚海域应该还有很多隐存种没有被人发现。王中铎等利用COI基因对南海硬骨鱼类进行研究时发现，COI基因可用于硬骨鱼类的物种鉴别，并可用于低级分类阶元的系统进化分析。这些研究表明，COI基因不仅可以用于动物物种的鉴定，还可以用于分析物种的系统进化历程，寻找物种基因差异性原因，这对于动物隐存种的发现及生物多样性的保护具有一定的实际意义。
3.DNA条形码在软体动物中的应用
软体动物种类较多，现存种类大约8万种，为世界第二大门类，目前海洋生软体动物已有不少报道。Johnson等对20个种类的帽贝（Lepetodrilus limpets）进行分析发现，大部分种都可以通过COI基因进行区别开。Mikkelsen等[对12种双壳类的COI基因进行分析，结果显示种内差异和种间差异没有重叠，COI基因还可以作为双壳类的DNA条形码。COI基因由于其具有较快的进化速率，且PCR扩增较容易，已经越来越多的被应用到软体动物的鉴别研究。 4.DNA条形码在鸟类中的应用
哺乳动物是和人类生产活动密切相关的一类动物，目前对于哺乳动物DNA条形码研究还较少，主要研究集中在鸟类动物上。Efe等基于包括COI 和Cytb在内5种基因片段对濒危动物白嘴端燕鸥的研究发现，该物种还存在两个隐存种。Fleischer等[利用12SrDNA等6种线粒体基因对10种濒危象牙嘴啄木鸟的亲缘关系进行研究，结果表明其中7个来自北美洲自然博物馆，3个来自古巴野生种。Webb等[还利用COI基因，Cytb基因及12S基因对啄木鸟科部分鸟类进行系统发育相关研究，结果表明美洲类群的啄木鸟是来自于欧亚类群的入侵种。DNA条形码在鸟类中的应用研究比较广泛，其在揭示鸟类的进化历史，物种迁徙以及遗传漂变方面发挥了重要作用。
四、DNA条形码在畜牧产品中的应用前景
目前，DNA条形码技术在常用畜牧产品中的研究还比较少，国内仅有几篇文献开展了类似研究。李新光等[35]利用COI基因对外在形态一致的冷冻鱼、冻鱼片及烤鱼片中的鱼肉成分来源进行了鉴别，结果发现10 种冻鳕鱼片样品主要以“狭鳕”为主（7/10），存在将“白鳕鱼”标识为“银鳕鱼”的现象；烤鱼片样品与其标签上所标识的原料多数不符，一些烤鱼片还发现有月尾兔头鲀，说明DNA条形码技术可以用于畜牧产品的来源鉴定。徐向明[36]以我国3个地方品种鸭为研究对象，通过测定COI基因，发现3个地方的品种鸭具有与其他地方相区别的单倍型，并且也分别具有其各自的特异单倍型，说明利用COI基因可以鉴别不同地方鸭的品种。张蓉等[利用COI基因对市场上的花鹿茸，马鹿茸及其混伪品进行了准确的鉴别，进一步说明了DNA条形码在畜牧产品品种鉴别上的可行性。此外，Wang 等[通过测定浦东白猪和沙乌头猪线粒体控制区（mtDNA D-loop）序列，并利用太湖流域其他地方猪在GenBank里的序列信息，对这些地方猪的系统发育关系进行了分析，结果表明，太湖流域的这些地方猪种的系统发育树分为两大支，而浦东白猪只分布在其中的一支内，估计大约在0.26～0.75 亿年以前，浦东白猪与其他四种猪就已经分离开来，也就说浦东白猪是一个独立的地方猪种，与其他地方猪没有基因交流，应该作为一个单独品种进行保护。
畜牧产品在我国市场上占据相当大的比例，随着养殖业的发展，畜牧产品在市场上所占据的比例也会逐步增加，如何确保畜牧产品的来源准确，品种精确已经成为畜牧业发展中所面临的一个新问题。DNA条形码技术的发展给畜牧业带来了新的启发，尤其是对于外在形态相似的畜牧产品来说，运用DNA条形码技术对其进行准确的来源鉴定将对控制畜牧产品的品种与质量，维护市场秩序，保证消费者及第三方利益具有重要的意义。另外，目前在畜牧业发展中保护稀缺品种也是实现畜牧业可持续发展的一个重要举措，基于DNA条形码技术可以估计物种的遗传多样性及系统进化历程，推测物种的起源中心，将其应用于畜牧业中濒危物种的保护也具有一定的可行性。因此，DNA条形码技术在畜牧产品中具有极大的应用前景，将其引进并合理应用对于畜牧业发展具有非常重要的意义。
参考文献
[1] Tautz D，Arctander P，Minelli A， et a1.DNA points the way ahead in taxonomy.Nature 2002，4l8（6897）：479.
[2] Hebert P，Cywinska A，Ball S L，et a1.Biological identifications through DNA barcodes.Proc R Soc Lond B，2003a，270（1512）：313～ 321.
[3] Hebert P，Ratnasingham S，W aard J D.Barcoding animal life：cytochrome coxidase
subunit 1 divergences among closely related species.Proc R Soc Lond B （Supp1），2003，270：S96～ S99.
[4] 程佳月，王丽华，彭克美，等.国际生命条形码计划——DNA Barcoding[J].中国畜牧兽医，2009，36（8）：49～53.
[5] 肖金花，肖晖，黄大卫.生物分类学的新动向—— DNA条形编码[J].动物学报，2004，50（5）：852～855.
[6] Folmer O， Black M， Hoeh W， et al. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochromecoxidase subunit I from diversemetazoan invertebrates[J]. Mol Mar Biol Biotechnol， 1994， 3：294-299.
[7] 陈士林，姚辉，韩建萍，等.中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[J].中国中药杂志，2013，38（2）：141～147.
[8] 赵志常，陈业渊，高爱平，等.改良CTAB法提取番石榴总DNA的初步研究[J].北方园艺，2013，9：123～125.
[9] 许理文，王凤格，赵久然，等.高盐低PH值法提取玉米基因组DNA的研究 [J].玉米科学，2009，17（1）：59～61.
[10] 徐广，郭予元，梁革梅，等.SDS-苯酚法提取高质量的棉铃虫DNA [J].昆虫知识，2000，37（3）：174～178.
[11] 易庆平，罗正荣，张青林.植物总基因组DNA提取纯化方法综述 [J].安徽农业科学，2007，35（25）：7789～7791.
[12] 周丽，李飞，魏刚.动物DNA提取方法概述[J]. Animal Husbandry
[关键词] DNA条形码 COI 畜牧产品 前景
[中图分类号] Q819 [文献标识码] A [文章编号] 1003-1650 （2014）01-0252-02
近年来，DNA条形码技术受到了国际和国内的高度关注，并在动植物的鉴定领域得到了广泛应用。DNA条形码技术首先是由Tautz[1]等在2002年提出，并将其应用于生物分类系统，Hebert等[2，3]在2003年首次提出DNA条形码（DNA Barcoding）概念，并将其用于快速鉴定物种的标记物。到目前为止，国际上已经建立了包括生命条码联合会（Consortium forthe Barcode of Life， CBOL，http：// w ww.barcodeoflife.org），生命条码数据库（Barcode of Life Datasystems， BOLD，http：//www.boldsystems.org），以及国际生命条码计划（International Barcode of Life， iBOL，http：//www.ibol.org）在内的3个大型资源网站，吸引了50多个国家的投资者及合作组织。这些生命条码组织的成立，进一步推动了DNA条形码技术的发展。近年来，中国本土也形成了很多包括植物、动物及中药材在内的生物DNA条形码数据库，为物种鉴定及生物系统发育研究的发展提供了有力的基因证据。
一、DNA条形码技术的原理
条形码技术是一种通过对条形码进行电子扫描，从而实现对信息进行快速、准确的自动识别方法，目前已广泛应用与商品零售业[4]。DNA条形码与之类似，即利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定及其相关研究。DNA序列是由A、T、G、C 4种碱基组成，不同的碱基数目分别以不同的顺序进行排列组合就会有足够多数目的基因序列，从而包括所有物种的基因型[5，6]。
二、DNA条形码操作的方法流程
1.样品处理及DNA提取 首先对样品进行液氮冷冻及酒精消毒等处理工作。其次是进行DNA提取，DNA提取方法一般包括破碎细胞壁并释放DNA，分离DNA，纯化DNA，DNA浓缩、沉淀与洗涤等基本步骤[7]。目前常用的DNA提取方法有CTAB[8]法，高盐低PH[9]法，SDS[10]法以及试剂盒提取法等。对于植物样品，一般选择CTAB法 [11]，对于动物样品，一般采用SDS（十二烷基硫酸钠）原理提取DNA [12]。随着近年来DNA提取试剂盒的问世，试剂盒法已经广泛用于动植物DNA的提取。
2.PCR扩增
PCR（聚合酶链式反应）扩增就是使提取出的样品DNA在PCR扩增仪内进行反应，以达到DNA的数量成指数增长的效果。对于植物PCR扩增，目前国内一般采用叶绿体基因[13，4]和核基因[15]片段为目的基因。对于动物的PCR扩增，国内应用最多的动物条形码是COI基因。另外，线粒体基因以及核基因也越来越多的被用于动物研究中。
3.PCR产物检测及测序
目前，一般采取琼脂糖凝胶电泳方法检测 PCR产物，采用Sanger双向测序的方法。随着高通量测序技术的发展，国内的测序技术也在进一步提高。
4.获得DNA条形码 将测序返回的结果利用Choromas软件查看峰图质量，ContingExpress软件进行双向序列拼接，Bioedit软件进行序列编辑，最终获得DNA条形码。
三、DNA条形码技术在动物研究中的应用
1.DNA条形码在昆虫中的应用
早在21世纪初，我国学者就已经利用线粒体COI基因对线虫、蛔虫、水蚤和吸虫等线形动物进行了序列差异研究。之后Hajibabaei M等基于COI基因对鳞翅目521种昆虫进行了序列分析，发现对其物种鉴别效率可以达到97.9%。潘程莹等对7种蝗虫的线粒体COI基因进行了研究，发现基于COI基因可以实现对蝗虫的鉴别，并揭示了蝗虫的系统进化历程。这表明DNA条形码在昆虫类的鉴别研究中已经相当成熟。
2.DNA条形码在鱼类中的应用
DNA条形码在鱼类中的开发和应用也较为广泛。Ward等对澳大利亚207种海洋鱼类进行分析，发现所有物种在COI基因上都有一定差异，通过系统发育关系的构建，发现COI基因可作为海洋鱼类DNA条形码的标准序列。此外，Zemlak等用COI基因研究印度洋沿岸35种鱼的229个样本发现，南非和澳大利亚海域的同种鱼类存在很大的差异，指出南非和澳大利亚海域应该还有很多隐存种没有被人发现。王中铎等利用COI基因对南海硬骨鱼类进行研究时发现，COI基因可用于硬骨鱼类的物种鉴别，并可用于低级分类阶元的系统进化分析。这些研究表明，COI基因不仅可以用于动物物种的鉴定，还可以用于分析物种的系统进化历程，寻找物种基因差异性原因，这对于动物隐存种的发现及生物多样性的保护具有一定的实际意义。
3.DNA条形码在软体动物中的应用
软体动物种类较多，现存种类大约8万种，为世界第二大门类，目前海洋生软体动物已有不少报道。Johnson等对20个种类的帽贝（Lepetodrilus limpets）进行分析发现，大部分种都可以通过COI基因进行区别开。Mikkelsen等[对12种双壳类的COI基因进行分析，结果显示种内差异和种间差异没有重叠，COI基因还可以作为双壳类的DNA条形码。COI基因由于其具有较快的进化速率，且PCR扩增较容易，已经越来越多的被应用到软体动物的鉴别研究。 4.DNA条形码在鸟类中的应用
哺乳动物是和人类生产活动密切相关的一类动物，目前对于哺乳动物DNA条形码研究还较少，主要研究集中在鸟类动物上。Efe等基于包括COI 和Cytb在内5种基因片段对濒危动物白嘴端燕鸥的研究发现，该物种还存在两个隐存种。Fleischer等[利用12SrDNA等6种线粒体基因对10种濒危象牙嘴啄木鸟的亲缘关系进行研究，结果表明其中7个来自北美洲自然博物馆，3个来自古巴野生种。Webb等[还利用COI基因，Cytb基因及12S基因对啄木鸟科部分鸟类进行系统发育相关研究，结果表明美洲类群的啄木鸟是来自于欧亚类群的入侵种。DNA条形码在鸟类中的应用研究比较广泛，其在揭示鸟类的进化历史，物种迁徙以及遗传漂变方面发挥了重要作用。
四、DNA条形码在畜牧产品中的应用前景
目前，DNA条形码技术在常用畜牧产品中的研究还比较少，国内仅有几篇文献开展了类似研究。李新光等[35]利用COI基因对外在形态一致的冷冻鱼、冻鱼片及烤鱼片中的鱼肉成分来源进行了鉴别，结果发现10 种冻鳕鱼片样品主要以“狭鳕”为主（7/10），存在将“白鳕鱼”标识为“银鳕鱼”的现象；烤鱼片样品与其标签上所标识的原料多数不符，一些烤鱼片还发现有月尾兔头鲀，说明DNA条形码技术可以用于畜牧产品的来源鉴定。徐向明[36]以我国3个地方品种鸭为研究对象，通过测定COI基因，发现3个地方的品种鸭具有与其他地方相区别的单倍型，并且也分别具有其各自的特异单倍型，说明利用COI基因可以鉴别不同地方鸭的品种。张蓉等[利用COI基因对市场上的花鹿茸，马鹿茸及其混伪品进行了准确的鉴别，进一步说明了DNA条形码在畜牧产品品种鉴别上的可行性。此外，Wang 等[通过测定浦东白猪和沙乌头猪线粒体控制区（mtDNA D-loop）序列，并利用太湖流域其他地方猪在GenBank里的序列信息，对这些地方猪的系统发育关系进行了分析，结果表明，太湖流域的这些地方猪种的系统发育树分为两大支，而浦东白猪只分布在其中的一支内，估计大约在0.26～0.75 亿年以前，浦东白猪与其他四种猪就已经分离开来，也就说浦东白猪是一个独立的地方猪种，与其他地方猪没有基因交流，应该作为一个单独品种进行保护。
畜牧产品在我国市场上占据相当大的比例，随着养殖业的发展，畜牧产品在市场上所占据的比例也会逐步增加，如何确保畜牧产品的来源准确，品种精确已经成为畜牧业发展中所面临的一个新问题。DNA条形码技术的发展给畜牧业带来了新的启发，尤其是对于外在形态相似的畜牧产品来说，运用DNA条形码技术对其进行准确的来源鉴定将对控制畜牧产品的品种与质量，维护市场秩序，保证消费者及第三方利益具有重要的意义。另外，目前在畜牧业发展中保护稀缺品种也是实现畜牧业可持续发展的一个重要举措，基于DNA条形码技术可以估计物种的遗传多样性及系统进化历程，推测物种的起源中心，将其应用于畜牧业中濒危物种的保护也具有一定的可行性。因此，DNA条形码技术在畜牧产品中具有极大的应用前景，将其引进并合理应用对于畜牧业发展具有非常重要的意义。
参考文献
[1] Tautz D，Arctander P，Minelli A， et a1.DNA points the way ahead in taxonomy.Nature 2002，4l8（6897）：479.
[2] Hebert P，Cywinska A，Ball S L，et a1.Biological identifications through DNA barcodes.Proc R Soc Lond B，2003a，270（1512）：313～ 321.
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[4] 程佳月，王丽华，彭克美，等.国际生命条形码计划——DNA Barcoding[J].中国畜牧兽医，2009，36（8）：49～53.
[5] 肖金花，肖晖，黄大卫.生物分类学的新动向—— DNA条形编码[J].动物学报，2004，50（5）：852～855.
[6] Folmer O， Black M， Hoeh W， et al. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochromecoxidase subunit I from diversemetazoan invertebrates[J]. Mol Mar Biol Biotechnol， 1994， 3：294-299.
[7] 陈士林，姚辉，韩建萍，等.中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[J].中国中药杂志，2013，38（2）：141～147.
[8] 赵志常，陈业渊，高爱平，等.改良CTAB法提取番石榴总DNA的初步研究[J].北方园艺，2013，9：123～125.
[9] 许理文，王凤格，赵久然，等.高盐低PH值法提取玉米基因组DNA的研究 [J].玉米科学，2009，17（1）：59～61.
[10] 徐广，郭予元，梁革梅，等.SDS-苯酚法提取高质量的棉铃虫DNA [J].昆虫知识，2000，37（3）：174～178.
[11] 易庆平，罗正荣，张青林.植物总基因组DNA提取纯化方法综述 [J].安徽农业科学，2007，35（25）：7789～7791.
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