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【摘要】目的：探讨哈尼族验方“莫那奇”对大鼠脑出血（ICH）后神经缺损体征及脑组织中脑源性神经营养因子（BDNF）阳性细胞数的干预作用。方法：40只SD大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组和莫那奇组各10只，以自体血注入法建立大鼠ICH模型，以Berderson评分法对其神经缺损体征进行评分，应用原位杂交方法检测干预后BDNF阳性细胞数的变化。结果：与模型组比较，莫那奇组大鼠神经缺损体征有一定程度恢复，脑组织BDNF阳性细胞数显著增加，具有统计学意义（P<0.01）。空白组和假手术组基本无阳性表达细胞。结论：哈尼族验方“莫那奇”促进神经缺损体征恢复和脑组织中BDNF阳性细胞数的增加可能是其治疗脑出血后神经损伤的重要机制之一。
【关键词】哈尼族；BDNF；脑出血；脑组织修复
【中图分类号】R29 【文献标志码】A 【文章编号】1007-8517（2015）23-0003-02
脑出血（intra cerebral hemorrhage，ICH）是指原发性脑实质的非创伤性出血，是临床常见的脑血管疾病。ICH后脑损伤的缓解和治疗是临床实践中重要的环节[1]，在降低患者致残率和死亡率、改善患者生活质量方面起重要作用。哈尼族验方“莫那奇”在长期临床治疗ICH中效果显著，本实验以ICH大鼠模型作为治疗对象，探讨“莫那奇”对大鼠脑出血（ICH）后神经缺损体征及脑组织中脑源性神经营养因子（BDNF）阳性细胞数的干预作用，以揭示其治疗ICH的作用机理。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 健康成年昆明种SD大鼠40只，雌雄各20只，体重在220～240g，由昆明医科大学动物实验中心提供，动物质量合格证书号：SCXK（滇）2011-0004。随机分为四组：正常组、假手术、模型组、莫那奇组各10只。实验前动物先在实验室适应环境2周，常规饲养，体重达到250～280g时开始造模；造模前禁食12h，禁水6h；实验中，剔除死亡和不合格者，及时追加动物以补充模型。
1.2 仪器设备与试剂 脑立体定位仪（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；石蜡切片机（LEICA，德国）；光学显微镜（LEICA，德国）；手术器械（上海医疗器械集团有限公司）；乙醇（成都化学试剂厂，分析纯AR）；水合氯醛（上海试剂公司，分析纯AR），0.1 M PBS（NaCl 9g+NaH2PO4·2H2O 2.964g+Na2HPO4·12H2O 29.01g+蒸馏水至1000ml）；0.1%DEPC溶液（lmlDEPC+999mlPBS）；4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2～7.6）（多聚甲醛40g+0.1%DEPC溶液至1000ml）；BDNF原位杂交试剂盒（武汉博士德公司）；莫那奇汤（老虎刺皮、黑皮跌打、山皮条、满山香、藤蕉、大荃麻、松节、杨梅皮、天红地绿等各9g，浓度为1200g生药/L）。
1.3 ICH模型的制备和筛选 手术器械消毒备用，参照并改进Rosenberg等[2]报道的方法制作ICH大鼠模型。大鼠造模完成待大鼠清醒后，采用Berderson[3]评分法，筛选成功模型动物。根据Berderson神经体征评分法：轻抓尾巴，提起高于桌面10cm，正常大鼠前爪伸直。0分：无神经功能缺损；1分：脑部病变对侧腕关节、肘关节屈曲，肩内收屈曲；2分：上述体征阳性，向麻痹侧推阻力下降；3分：活动时向麻痹侧打圈（呈追尾状）。分数在1分以上（包括1分）即为造模成功。
1.4 各组实验动物干预方法 空白组：10只大鼠，不做任何手术处理，常规饲养，每日灌胃生理盐水1ml，每日1次，连续3d。假手术组：10只大鼠，分别用10%水合氯醛（0.4ml/100g）腹腔注射麻醉，俯卧位固定于立体定位仪上，术中微量注射器沿钻孔进针约6mm，留针约7min，缓慢出针，处理创面，清醒后常规饲养，每日灌胃生理盐水1ml，每日1次，连续3d。模型组：10只，造模后不治疗，常规饲养，每日灌胃生理盐水1ml，每日1次，连续3d。莫那奇组：每日按生药4.5g/kg体重/d给予莫那奇汤灌胃，每日1次，连续3d。各组大鼠在造模3d后重新进行Berderson神经体征评分。
1.5 标本采集 大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.4ml/100g深麻醉，顺序灌注生理盐水和4%多聚甲醛/0.1M PBS（PH7.2～7.4）各约200ml，灌注完毕后在冰浴中快速开颅并取出完整脑，距注射针孔前后各约2mm冠状切开，将标本放入4%多聚甲醛溶液中固定。
1.6 制作石蜡切片 固定脑组织30～40min后冲水2～3h，脱水透明（将脑组织依次浸入70%乙醇3h、80%乙醇2h、90%乙醇过夜、95%乙醇2h、无水乙醇Ⅰ0.5h、无水乙醇Ⅱ0.5h、二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min），浸蜡（将脑组织依次浸入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ各2h），包埋后切片（片厚5μm）。将切片放入60℃烤箱2h。
1.7 原位杂交检测BDNF 石蜡切片常规脱蜡，滴加3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶，后固定，预杂交，杂交，洗涤，滴加封闭液，滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加SABC，滴加生物素化过氧化物酶，DAB显色，必要时苏木素复染，充分水洗，脱水，透明，封片。
1.8 图像分析 利用病理图像分析软件，在400倍光镜下，随机选取每张切片ICH血肿周边5个不同视野，阳性细胞呈褐色或棕黄色，区分各切片所选视野内阳性细胞并计数。
1.9 统计学处理 使用统计软件进行数据分析，各组数据用x±s表示，各组间比较采用单因素方差分析 （One-Way ANOVA），方差齐时选用LSD法，方差不齐时选择秩和检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠Berderson神经体征评分比较 莫那奇组、模型组大鼠均表现不同程度的出血对侧偏瘫，莫那奇组与模型组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。空白组和假手术组大鼠无神经功能异常。见表1。 2.2 各组大鼠脑组织BDNF阳性细胞数的比较 莫那奇组、模型组分别与空白组、假手术组进行比较，BDNF阳性细胞数差异具有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，莫那奇组大鼠脑组织BDNF阳性细胞数显著增加，具有统计学意义（P<0.01）。空白组和假手术组基本无阳性表达细胞。见表2。
3 讨论
脑出血是中老年人多发病种，起因复杂，病理机制尚不明确，并发症和后遗症多，其高发病率、高致残率和高死亡率给病患生活带来极大困扰，因此也是广大医务工作者和基础科研的重点研究对象。
临床上脑出血急性期多采用手术疗法，如开颅清除血肿、降颅压、穿刺抽吸血肿、血性脑液引流等，一般疗法包括吸氧、控制血压、降温、防治并发症等辅助措施，但老年人由于体质弱、耐受差、术后易感染，不宜施行手术，因此寻找安全有效的疗法对中老年患者十分必要。传统医药治疗脑出血有丰富的经验积累，能有效减轻出血后脑组织损伤程度，提高患者生活质量，目前应用较多的传统方法多为中草药制剂，如川芎嗪、羚角钩藤汤、镇肝熄风汤等[4]。
哈尼族医药作为祖国传统医药的重要组成部分，已有数千年的发展历史，其以多样的疗法和显著的疗效，有力地保障了哈尼族的文明延续，备受哈尼人民尊重。墨江县委党校医务室胡氏之“莫那奇”，哈尼族用语，意为“中风、风湿麻木很好的药”。莫那奇由哈尼族民族民间草药为主组成：老虎刺皮（骆铭傲割阿孜）、黑皮跌打（啊纳呃积赤）、山皮条（呃壳呃积）、满山香（约茅腻）、藤蕉（札柯倍都耶）、大荃麻（和茄榪）、松节（托自阿尼）、杨梅皮（昔切呃积）、天红地绿（咪呢秘尼）等（括号内药名为哈尼用语）。主要功效为活血化瘀、行气止痛、通经活络。其中天红地绿、满山香、藤焦等辛辣芳香，为健脾理气之品，能行气活血；黑皮跌打、杨梅皮、老虎刺皮、山皮条等有活血止血的功效。哈尼医药与中医药理论有许多相通和相似之处，为现代医学对其研究提供了很好的契机。研究表明，脑出血后脑内瘀血、水肿、血红蛋白毒性、继发性脑缺血等多种因素致使胞内凋亡信号通路激活，氧自由基增加，最终导致细胞凋亡或死亡。BDNF是最重要的脑源性神经营养因子[5]，广泛分布于神经系统中，有促进神经元生长发育、保护和修复损伤的作用[6-7]。生理状态下BDNF阳性细胞表达较少，ICH出血灶周围组织中BDNF阳性细胞数量显著增多，BDNF表达上升，其受体TrkB与BDNF表达协同上调，有实验证实，BDNF通过激活其受体TrkB，阻断胞内损伤因子对蛋白激酶C的失活，来防止神经元发生变性、死亡[8]。石秋艳等[9]研究发现，ICH后诱导BDNF蛋白表达，有利于对损伤NCs的保护和修复。本实验中，莫那奇汤组与对照组相比，大鼠神经缺损体征有一定程度的恢复，有统计学意义，脑出血病灶周围组织中BDNF阳性细胞数量增加显著，由此推断，莫那奇汤促进脑组织BDNF的表达，有利于损伤神经元的保护和修复，可能是其治疗脑出血的机制之一。
参考文献
[1]皮志杰. 脑出血的病因病理变化及治疗进展[J]. 咸宁学院学报（医学版），2009（05）： 457-458.
[2]Gary A Rosenberg，S Mun-Bryce，M Wesley，et al. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats[J].Stroke，1990，21（5）： 801.
[3]Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M.Rat middle cerebral artery occlusion： evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke，1986，17（3）： 472.
[4]焦健，徐淑娜.羚羊钩藤汤临证加减治疗高龄脑出血患者临床研究[J].中国实用神经疾病杂志，2015（07）：21-23.
[5]Schabitz WR，Steigleder T，Cooper-Kuhn CM，et al.Intravenous brain-derived neurotrophic factor enhances poststroke sensorimotor recovery and stimulates neurogenesis[J]. Stroke，2007， 38（7）： 2165-2172.
[6]Melina L Willsom，Catriona Mcelnea，Jean Mariani，et al.BDNF increases homotypic olivocerebellar reinnervation and associated fine motor and cognitive skill[J]. Brain，2008， 131（4）： 1099-1112.
[7]Xing-Yun Song，Fang Li，Feng-He Zhang，et al. Peripherally-derived BDNF promotes regeneration of ascending sensory neurons after spinal cord injury[J]. Pl One，2008， 3（3）： 1707.
[8]周晖，毛萌.脑源性神经营养因子对缺氧胚鼠脑皮质神经元的保护作用[J].华西医大学报，2002，33（4）：573-576.
[9]石秋艳，何俊芳，孙惠芳. 脑出血大鼠脑内 NGF 和 BDNF 蛋白表达变化的研究[J]. 中国医药指南，2010（07）： 8-10.
（收稿日期：2015.10.12）
【关键词】哈尼族；BDNF；脑出血；脑组织修复
【中图分类号】R29 【文献标志码】A 【文章编号】1007-8517（2015）23-0003-02
脑出血（intra cerebral hemorrhage，ICH）是指原发性脑实质的非创伤性出血，是临床常见的脑血管疾病。ICH后脑损伤的缓解和治疗是临床实践中重要的环节[1]，在降低患者致残率和死亡率、改善患者生活质量方面起重要作用。哈尼族验方“莫那奇”在长期临床治疗ICH中效果显著，本实验以ICH大鼠模型作为治疗对象，探讨“莫那奇”对大鼠脑出血（ICH）后神经缺损体征及脑组织中脑源性神经营养因子（BDNF）阳性细胞数的干预作用，以揭示其治疗ICH的作用机理。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 健康成年昆明种SD大鼠40只，雌雄各20只，体重在220～240g，由昆明医科大学动物实验中心提供，动物质量合格证书号：SCXK（滇）2011-0004。随机分为四组：正常组、假手术、模型组、莫那奇组各10只。实验前动物先在实验室适应环境2周，常规饲养，体重达到250～280g时开始造模；造模前禁食12h，禁水6h；实验中，剔除死亡和不合格者，及时追加动物以补充模型。
1.2 仪器设备与试剂 脑立体定位仪（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；石蜡切片机（LEICA，德国）；光学显微镜（LEICA，德国）；手术器械（上海医疗器械集团有限公司）；乙醇（成都化学试剂厂，分析纯AR）；水合氯醛（上海试剂公司，分析纯AR），0.1 M PBS（NaCl 9g+NaH2PO4·2H2O 2.964g+Na2HPO4·12H2O 29.01g+蒸馏水至1000ml）；0.1%DEPC溶液（lmlDEPC+999mlPBS）；4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2～7.6）（多聚甲醛40g+0.1%DEPC溶液至1000ml）；BDNF原位杂交试剂盒（武汉博士德公司）；莫那奇汤（老虎刺皮、黑皮跌打、山皮条、满山香、藤蕉、大荃麻、松节、杨梅皮、天红地绿等各9g，浓度为1200g生药/L）。
1.3 ICH模型的制备和筛选 手术器械消毒备用，参照并改进Rosenberg等[2]报道的方法制作ICH大鼠模型。大鼠造模完成待大鼠清醒后，采用Berderson[3]评分法，筛选成功模型动物。根据Berderson神经体征评分法：轻抓尾巴，提起高于桌面10cm，正常大鼠前爪伸直。0分：无神经功能缺损；1分：脑部病变对侧腕关节、肘关节屈曲，肩内收屈曲；2分：上述体征阳性，向麻痹侧推阻力下降；3分：活动时向麻痹侧打圈（呈追尾状）。分数在1分以上（包括1分）即为造模成功。
1.4 各组实验动物干预方法 空白组：10只大鼠，不做任何手术处理，常规饲养，每日灌胃生理盐水1ml，每日1次，连续3d。假手术组：10只大鼠，分别用10%水合氯醛（0.4ml/100g）腹腔注射麻醉，俯卧位固定于立体定位仪上，术中微量注射器沿钻孔进针约6mm，留针约7min，缓慢出针，处理创面，清醒后常规饲养，每日灌胃生理盐水1ml，每日1次，连续3d。模型组：10只，造模后不治疗，常规饲养，每日灌胃生理盐水1ml，每日1次，连续3d。莫那奇组：每日按生药4.5g/kg体重/d给予莫那奇汤灌胃，每日1次，连续3d。各组大鼠在造模3d后重新进行Berderson神经体征评分。
1.5 标本采集 大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.4ml/100g深麻醉，顺序灌注生理盐水和4%多聚甲醛/0.1M PBS（PH7.2～7.4）各约200ml，灌注完毕后在冰浴中快速开颅并取出完整脑，距注射针孔前后各约2mm冠状切开，将标本放入4%多聚甲醛溶液中固定。
1.6 制作石蜡切片 固定脑组织30～40min后冲水2～3h，脱水透明（将脑组织依次浸入70%乙醇3h、80%乙醇2h、90%乙醇过夜、95%乙醇2h、无水乙醇Ⅰ0.5h、无水乙醇Ⅱ0.5h、二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min），浸蜡（将脑组织依次浸入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ各2h），包埋后切片（片厚5μm）。将切片放入60℃烤箱2h。
1.7 原位杂交检测BDNF 石蜡切片常规脱蜡，滴加3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶，后固定，预杂交，杂交，洗涤，滴加封闭液，滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加SABC，滴加生物素化过氧化物酶，DAB显色，必要时苏木素复染，充分水洗，脱水，透明，封片。
1.8 图像分析 利用病理图像分析软件，在400倍光镜下，随机选取每张切片ICH血肿周边5个不同视野，阳性细胞呈褐色或棕黄色，区分各切片所选视野内阳性细胞并计数。
1.9 统计学处理 使用统计软件进行数据分析，各组数据用x±s表示，各组间比较采用单因素方差分析 （One-Way ANOVA），方差齐时选用LSD法，方差不齐时选择秩和检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠Berderson神经体征评分比较 莫那奇组、模型组大鼠均表现不同程度的出血对侧偏瘫，莫那奇组与模型组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。空白组和假手术组大鼠无神经功能异常。见表1。 2.2 各组大鼠脑组织BDNF阳性细胞数的比较 莫那奇组、模型组分别与空白组、假手术组进行比较，BDNF阳性细胞数差异具有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，莫那奇组大鼠脑组织BDNF阳性细胞数显著增加，具有统计学意义（P<0.01）。空白组和假手术组基本无阳性表达细胞。见表2。
3 讨论
脑出血是中老年人多发病种，起因复杂，病理机制尚不明确，并发症和后遗症多，其高发病率、高致残率和高死亡率给病患生活带来极大困扰，因此也是广大医务工作者和基础科研的重点研究对象。
临床上脑出血急性期多采用手术疗法，如开颅清除血肿、降颅压、穿刺抽吸血肿、血性脑液引流等，一般疗法包括吸氧、控制血压、降温、防治并发症等辅助措施，但老年人由于体质弱、耐受差、术后易感染，不宜施行手术，因此寻找安全有效的疗法对中老年患者十分必要。传统医药治疗脑出血有丰富的经验积累，能有效减轻出血后脑组织损伤程度，提高患者生活质量，目前应用较多的传统方法多为中草药制剂，如川芎嗪、羚角钩藤汤、镇肝熄风汤等[4]。
哈尼族医药作为祖国传统医药的重要组成部分，已有数千年的发展历史，其以多样的疗法和显著的疗效，有力地保障了哈尼族的文明延续，备受哈尼人民尊重。墨江县委党校医务室胡氏之“莫那奇”，哈尼族用语，意为“中风、风湿麻木很好的药”。莫那奇由哈尼族民族民间草药为主组成：老虎刺皮（骆铭傲割阿孜）、黑皮跌打（啊纳呃积赤）、山皮条（呃壳呃积）、满山香（约茅腻）、藤蕉（札柯倍都耶）、大荃麻（和茄榪）、松节（托自阿尼）、杨梅皮（昔切呃积）、天红地绿（咪呢秘尼）等（括号内药名为哈尼用语）。主要功效为活血化瘀、行气止痛、通经活络。其中天红地绿、满山香、藤焦等辛辣芳香，为健脾理气之品，能行气活血；黑皮跌打、杨梅皮、老虎刺皮、山皮条等有活血止血的功效。哈尼医药与中医药理论有许多相通和相似之处，为现代医学对其研究提供了很好的契机。研究表明，脑出血后脑内瘀血、水肿、血红蛋白毒性、继发性脑缺血等多种因素致使胞内凋亡信号通路激活，氧自由基增加，最终导致细胞凋亡或死亡。BDNF是最重要的脑源性神经营养因子[5]，广泛分布于神经系统中，有促进神经元生长发育、保护和修复损伤的作用[6-7]。生理状态下BDNF阳性细胞表达较少，ICH出血灶周围组织中BDNF阳性细胞数量显著增多，BDNF表达上升，其受体TrkB与BDNF表达协同上调，有实验证实，BDNF通过激活其受体TrkB，阻断胞内损伤因子对蛋白激酶C的失活，来防止神经元发生变性、死亡[8]。石秋艳等[9]研究发现，ICH后诱导BDNF蛋白表达，有利于对损伤NCs的保护和修复。本实验中，莫那奇汤组与对照组相比，大鼠神经缺损体征有一定程度的恢复，有统计学意义，脑出血病灶周围组织中BDNF阳性细胞数量增加显著，由此推断，莫那奇汤促进脑组织BDNF的表达，有利于损伤神经元的保护和修复，可能是其治疗脑出血的机制之一。
参考文献
[1]皮志杰. 脑出血的病因病理变化及治疗进展[J]. 咸宁学院学报（医学版），2009（05）： 457-458.
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[3]Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M.Rat middle cerebral artery occlusion： evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke，1986，17（3）： 472.
[4]焦健，徐淑娜.羚羊钩藤汤临证加减治疗高龄脑出血患者临床研究[J].中国实用神经疾病杂志，2015（07）：21-23.
[5]Schabitz WR，Steigleder T，Cooper-Kuhn CM，et al.Intravenous brain-derived neurotrophic factor enhances poststroke sensorimotor recovery and stimulates neurogenesis[J]. Stroke，2007， 38（7）： 2165-2172.
[6]Melina L Willsom，Catriona Mcelnea，Jean Mariani，et al.BDNF increases homotypic olivocerebellar reinnervation and associated fine motor and cognitive skill[J]. Brain，2008， 131（4）： 1099-1112.
[7]Xing-Yun Song，Fang Li，Feng-He Zhang，et al. Peripherally-derived BDNF promotes regeneration of ascending sensory neurons after spinal cord injury[J]. Pl One，2008， 3（3）： 1707.
[8]周晖，毛萌.脑源性神经营养因子对缺氧胚鼠脑皮质神经元的保护作用[J].华西医大学报，2002，33（4）：573-576.
[9]石秋艳，何俊芳，孙惠芳. 脑出血大鼠脑内 NGF 和 BDNF 蛋白表达变化的研究[J]. 中国医药指南，2010（07）： 8-10.
（收稿日期：2015.10.12）