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人鼻病毒(HRV)是单股正链小RNA病毒,其编码的3C蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶家族,可以识别多肽序列LEVLFQ△GP,并在Gln和Gly之间进行切割。HRV 3C蛋白酶具有特异性强,酶活高等特性,即使在4℃低温条件下依然有较高的酶活。目前,HRV 3C蛋白酶已广泛商品化,特别是用来在蛋白纯化过程中移除纯化标签。然而,作为一种高价值的商业酶,HRV 3C蛋白酶的底物特异性还没有相关报道。这里,我们开发了一种利用酵母内质网滞留筛选系统(YESS)来快速解析蛋白酶底物切割位点特异性的新方法,并用这个方法解析了HRV 3C蛋白酶底物切割位点P1(Q),P1’(G),P2’(P)特异性,从而为其的进一步应用提供了指导依据。这一新方法省略了蛋白酶与其底物的表达、纯化、体外反应等一系列繁琐的过程,极大的简化了实验步骤,缩短了实验周期,并且操作简单、快捷、定量准确。蛋白酶和其底物的反应直接在内质网中完成,随后不同形式的底物被展示在细胞表面,通过荧光抗体标记即可对蛋白酶-底物特异性进行解析。针对P2’位点的全突变分析结果表面,这一新方法与传统的体外测定方法结果基本相符,说明了此方法的可靠性。随后,我们通过酵母内质网滞留信号肽的不同应用扩展了这一方法的动力学范围,快速、准确的解析了HRV3C蛋白酶针对其底物P1(Q)和P1’(G)位点的特异性。我们的初步研究表明,HRV3C蛋白酶在P1和P1’位点分别偏好Gln和Gly,然而在P2’位点相对原始的Pro氨基酸,更偏好Met。这一研究结果在开发了一种简单易行的方法的同时,发现了HRV 3C蛋白酶更偏好的切割底物,从而有利于HRV 3C蛋白酶的进一步应用和研究。