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铁皮石斛(Dendrobium)是我国传统名贵的中药材之一,据《中国药典2010》记载,铁皮石斛具有益胃生津,滋阴清热等功效。铁皮石斛多糖是其主要的药效成份之一。石斛中的多糖主要为葡甘露聚糖,1988年,王世林等从铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)中分离提取到三种β型的葡甘露聚糖;Hsieh等从霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)中分离到的β-1,4-葡甘露聚糖具有提高细胞因子转录水平的作用。为了解铁皮石斛多糖生物合成的机制,本研究以铁皮石斛茎段为材料,采用RT-PCR及RACE法克隆铁皮石斛多糖合成代谢途径中的磷酸甘露糖酶(phosphomannomutase;PMM)基因、GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-Mannose pyrophosphorylase;GMPase)基因以及β型甘露糖糖基转移酶(4-beta-Mannosyl-transferase)基因。GDP-Mannose是甘露糖的一种活化形式,直接为多糖的合成提供单糖。磷酸甘露糖酶(PMM)是一种双功能酶,催化D-Mannose-6-phosphate和D-Mannose-1-phosphate之间的互变,为下一步合成GDP-Mannose提供底物。克隆的PMM基因cDNA包括126bp的5’非编码区(Untranslatedregion,UTR),184bp的3’(Untranslatedregion,UTR)非编码区和759bp的开放阅读框(ORF),编码一个253个氨基酸的蛋白,分子量为28.617kD,理论等电点为5.90,与水稻OsPMM蛋白具有85%的相似性,与拟南芥的AtPMM蛋白具有77%的相似性。采用WoLFPSORT和BaCelLo生物在线软件对DoPMM蛋白的亚细胞定位预测,分析结果显示DoPMM定位在细胞质中,TMHMM软件分析没有跨膜区域。克隆了GMPase-1和GMPase-2两个GDP-Mannose焦磷酸酸化酶(GMPase)基因,其中GMPase-1基因的cDNA包括186bp的5’非编码区(UTR),257bp的3’非编码区(UTR)和1086bp的开放阅读框(ORF),编码一个362个氨基酸的蛋白,分子量为39.373kD,理论等电点为6.62;GMPase-2基因的cDNA包括11bp的5’非编码区(UTR)11bp,224bp的3’非编码区(UTR)和1248bp的开放阅读框(ORF),编码一个416个氨基酸的蛋白,分子量为45.875kD,理论等电点为6.44。GDP-Mannose焦磷酸酸化酶(GMPase)以D-Mannose-1-phosphate为底物,催化生产甘露糖的活化形式GDP-Mannose,为多糖的合成提底物。GMPase-1和GMPase-2蛋白进行TMHMM软件分析都没有发现跨膜区域。β型甘露糖糖基转移酶(4-beta-mannosyltransferase)主要参与β型的甘露聚糖的合成,以GDP-Mannose为底物,将甘露糖转移到糖链上。其cDNA包括392bp的5’非编码区(Untranslated region,UTR),482bp的3’非编码区(Untranslated region,UTR)和1611bp的开放阅读框(ORF),编码一个537个氨基酸的蛋白,分子量为61.168kD,理论等电点为9.11。TMHMM软件进行跨膜分析时,发现该基因编码的蛋白具有五个跨膜区域,这五个跨膜区域分别在50～72位氨基酸,365～387位氨基酸,407～429位氨基酸,487～506位氨基酸,511～533位氨基酸。在获得上述基因的全长后,我们将进一步研究其功能,为了解铁皮石斛多糖代谢途径打下基础。