肝脏虫卵肉芽肿炎症和继发性肝纤维化是血吸虫病致病的中心环节,其本质是由CD4⁺T淋巴细胞持续性对可溶性虫卵抗原产生免疫应答。CD4辅助性T细胞（Th,包括Th1,Th2,Th17,Tregs）介导的体液和细胞免疫应答在抗日本血吸虫的感染和免疫病理的形成发挥着重要的作用。研究表明,Th2、Th17极化与血吸虫感染宿主的慢性致病过程的发生、发展密切相关。已有报道Tfh在日本血吸虫和曼氏血吸虫病中都发挥着重要作用。然而其免疫调节机制尚未阐明。业已表明,ICOS与Tfh细胞的分化与功能密切相关。ICOS-ICOSL信号在血吸虫虫卵诱导的肉芽肿炎症及纤维化中发挥着重要作用,其血吸虫感染宿主的慢性致病过程中的免疫调节相关分子及其作用机制有待进一步阐明。本课题应用ICOSL^-/-、ICOSL^+/-及其野生型对照（WT）小鼠建立血吸虫病实验动物模型,探索ICOS-ICOSL共刺激信号在日本血吸虫感染宿主的慢性致病过程中对Tfh分化、极化以及生发中心反应的调控作用及重要信号分子,为深入阐明血吸虫病免疫病理的机制,寻找控制血吸虫性虫病晚期肝纤维化的发生发展的有效途径,提供科学依据。一、日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中Tfh介导的免疫应答特征及其免疫调节机制目的:探讨在日本血吸虫感染宿主慢性致病过程中,Tfh细胞的免疫应答特征及其免疫调节作用。方法:1.应用流式细胞术检测日本血吸虫感染前（0周）和感染早期（4周）、感染急性病变期（7周-9周）、感染慢性期（12周）、感染晚期（16周）的小鼠脾Tfh表面相关共刺激分子ICOS,PD-1,OX40,CD40L;转录因子Bcl-6;效应因子IL-21表达的动态变化,并观察分析Tfh增殖及相关标志分子表达与免疫病理形成的相关性。2.应用免疫荧光方法检测不同病期脾生发中心形成以及Tfh细胞迁移到生发中心的动态变化。分离不同病期Tfh细胞及B细胞共培养,抗IL-21功能阻断试验观察其对B细胞体液免疫应答影响。3.应用HE染色方法观察并分析不同病期感染鼠肝虫卵肉芽肿的病理变化,Masson染色观察并分析肝组织内胶原面积的动态变化;应用免疫组织化学的方法检测不同病期细胞因子IL-21及HSCs活化的标记分子α-SMA在肝虫卵肉芽肿周围表达的动态变化;应用流式细胞术及Real-time PCR的方法检测并比较日本血吸虫感染前后,小鼠HSCs IL-21R的表达水平的变化;并在日本血吸虫感染小鼠的肝脏中分离HSCs,体外培养,IL-21因子刺激,探讨IL-21对HSCs的影响。4.对日本血吸虫感染的小鼠腹腔注射IL-21因子,观察IL-21对肝脏病理形成和CD4⁺T细胞免疫应答的作用。结果:1.流式细胞术检测结果显示,小鼠脾CD4⁺T细胞表达Bcl-6从感染4周后显著上调,在感染后7周到达峰值,随后稍缓慢下调,但仍处于较高水平,同时也发现Tfh细胞增殖与日本血吸虫感染小鼠慢性致病的进程呈显著正相关。Tfh表面相关共刺激分子及效应因子IL-21的表达从感染4周后升高,在感染后7周进一步持续上调（P<0.05或P<0.01或P<0.001）,感染后9周稍下调,随后一直处于较高水平。2.免疫荧光结果显示:正常小鼠几乎无正常生发中心结构,在感染后4周有大量生发中心形成（P<0.001）,在感染后7周仍有大量生发中心存在,随后缓慢下降（P<0.01）。日本血吸虫感染小鼠后,随病程的进展,迁移到脾生发中心的Tfh细胞也逐渐增加。3.免疫组化结果显示:日本血吸虫感染小鼠肝脏虫卵肉芽肿周围IL-21⁺细胞从感染4周后开始升高（P<0.01）,在感染后12周到达峰值（P<0.001）,随后缓慢下降但仍处于较高水平（P>0.05）。正常小鼠HSCs即表达IL-21R,血吸虫感染小鼠HSCs表达的IL-21R上调（P<0.05）,用IL-21刺激后HSCs分泌HA增加（P<0.05）。4.体内IL-21刺激增加了小鼠肝虫卵肉芽肿的面积（P<0.001）,且上调了肝脏胶原的表达（P<0.001）。体内IL-21刺激对小鼠脾CD4⁺T细胞上CD69的表达及Tfh和Tregs细胞的增殖无明显作用。体内IL-21刺激促进了脾CD4⁺T淋巴细胞效应因子IFN-γ、IL-4、IL-17A的分泌（P<0.05或P<0.001）,但对IL-21的表达无明显影响。结论:Tfh增殖及极化与日本血吸虫感染小鼠慢性致病的进程呈显著正相关。Tfh细胞迁移到生发中心通过分泌效应因子IL-21促进B细胞体液免疫应答,而且IL-21因子能促进日本血吸虫感染小鼠的肝虫卵肉芽肿炎症及肝纤维化形成。二、ICOSL/ICOS信号通路在日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中对Tfh免疫调控作用目的:探讨ICOS-ICOSL共刺激信号在日本血吸虫感染小鼠的免疫病理形成中对Tfh分化、极化以及生发中心反应的调控作用。方法:1.应用HE染色方法观察并分析日本血吸虫感染前（0周）和感染早期（4周）、感染急性病变期（7周-9周）、感染慢性期（12周）、感染晚期（16周）的ICOSL^-/-、ICOSL^+/-及其WT小鼠肝虫卵肉芽肿的病理变化,并用Masson染色方法观察并分析日本血吸虫感染ICOSL^-/-、ICOSL^+/-及其WT小鼠不同病期肝组织内胶原表达的动态变化。2.应用流式细胞术检测日本血吸虫感染ICOSL^-/-、ICOSL^+/-及其WT小鼠不同病期脾、淋巴结、肝Tfh增殖、表面相关共刺激分子ICOS,PD-1,OX40,CD40L及转录因子Bcl-6表达的动态变化。3.应用流式细胞术检测日本血吸虫感染ICOSL^-/-、ICOSL^+/-及其WT小鼠不同病期脾、淋巴结、肝Th1/Th2/Th17/Tfh细胞效应因子（IFN-γ/IL-4/IL-17A/IL-21）表达的动态变化。4.应用免疫荧光的方法检测日本血吸虫感染前和感染后ICOSL^-/-、ICOSL^+/-及其WT小鼠脾生发中心形成的情况。5.应用免疫组织化学的方法检测日本血吸虫感染ICOSL^-/-、ICOSL^+/-及其WT小鼠不同病期肝虫卵肉芽肿周围转录因子Bcl-6及细胞因子IL-21表达的动态变化。结果:1.HE染色结果显示:在日本血吸虫感染后7周、9周,ICOSL^-/-小鼠肝虫卵肉芽肿的面积较其WT小鼠显著降低（P<0.01）,但在感染后期（感染后12周、16周）并无统计学差异。Masson染色结果显示:日本血吸虫感染ICOSL^-/-小鼠肝组织内肝纤维化程度较其WT小鼠有所减轻（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。2.日本血吸虫感染的ICOSL^-/-鼠与同期WT小鼠相比脾、淋巴结、肝CD4⁺T细胞转录因子Bcl-6及CXCR5表达显著下调（P<0.05或P<0.01或P<0.001）,Tfh表面相关共刺激分子的表达也明显下调（P<0.05或P<0.01或P<0.001）,并在整个病期都处于较低水平。日本血吸虫感染的ICOSL^+/-鼠与同期WT小鼠相比,虽有所下调,但无统计学差异。3.日本血吸虫感染的ICOSL^-/-鼠与同期WT小鼠相比CD4⁺T细胞IL-4/IL-17A/IL-21效应因子的表达也有不同程度的下调（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。日本血吸虫感染的ICOSL^+/-鼠与同期WT小鼠相比,虽有所下调,但无统计学意义。4.日本血吸虫感染前,ICOSL^-/-、ICOSL^+/-及其WT小鼠脾正常生发中心都少见,但日本血吸虫感染后（7周）,WT及ICOSL^+/-小鼠脾脏正常生发中心大量形成,而ICOSL^-/-鼠脾脏生发中心显著减少（P<0.001）,几乎无正常生发中心结构,即下调了GC免疫应答。5.免疫组化结果显示:日本血吸虫感染ICOSL^-/-小鼠肝脏虫卵肉芽肿周围炎症细胞转录因子Bcl-6及细胞因子IL-21的表达与同期WT小鼠相比显著下调（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。结论:阻断ICOS-ICOSL信号通路使得血吸虫性肝纤维化进程得到了一定程度的控制。ICOSL敲除下调了血吸虫感染宿主免疫应答过程中Tfh分化增殖,下调了Th2/Th17/Tfh效应因子的表达,降低了脾脏生发中心反应,即ICOS-ICOSL信号通路可能通过调控Th2、Th17、Tfh免疫应答从而发挥抗血吸虫病肝纤维化的作用。本研究结果表明,Tfh细胞及其效应因子IL-21在日本血吸虫感染鼠慢性致病过程发挥着重要的作用。调控共刺激信号ICOS-ICOSL可介导Tfh分化、极化从而下调或抑制血吸虫虫卵肉芽肿炎症及肝纤维化的发生发展。