目的:研究高效液相色谱-串联质谱联法(HPLC-MS/MS)同步测定培养液中多粘菌素E(colistin)和左氧氟沙星(levofloxacin)的方法学。方法 :待测样品用固相萃取(SPE)法进行预处理后,选用ZORBAX SB-C18柱(5μm,4.6×150mm,美国,Agilent),以乙腈(0.1%甲酸)-水(0.1%甲酸)(50:50,v/v)的比例为流动相,流速为0.3ml/min。采用多重反应选择离子检测(MRM)扫描方式进行检测,电喷雾离子源(ESI),colistin主要为colistin A和B的混合物,正离子模式下colistin A m/z585.5→m/z100.9,colistin B m/z578.5→m/z100.9,levofloxacin m/z362.2→m/z261.1。方法学确证包括方法特异性、标准曲线的制备、基质效应考察、提取回收率,准确度和精确度及稳定性考察等。结果 :本方法培养液中colistin和levofloxacin的线性范围为480ng/mL～9600ng/mL。定量下限为0.48μg/mL,以0.48μg/mL colistin和0.48μg/mL levofloxacin进行检测,其标准差(SD)为0.0124和0.0336,相对标准差(RSD)分别为2.5%和6.8%,准确度范围在97%～113%内。日内准确度范围在86.10%～111.05%,日间准确度范围为85.97%～115.70%,日内精密度(RSD)≤6.83%,日间精密度(RSD)≤9.85%。ME%大于85%,基质效应影响小。提取回收率为88.06%~104.43%,RSD≤4.15%。稳定性试验中,培养液中的colistin和levofloxacin贮存条件下较稳定。结论 :本试验首次建立了在培养液中应用高效液相色谱质谱联用技术同步测定colistin和levofloxacin浓度的方法学。经确证该方法学专属性好、灵敏、准确、快速,很好的满足了测定的要求。