盐酸小檗胺阻断自噬降解及其增强多柔比星抑制乳腺癌细胞活性的机制研究

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目的探讨盐酸小檗胺(BBM)阻断乳腺癌细胞自噬降解及其增敏多柔比星抑制乳腺癌细胞活性的分子机制。方法采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖活性;采用免疫印迹法(Western blot)检测细胞的蛋白表达水平;采用免疫共沉淀法(Co-IP)检测蛋白的相互结合;采用免疫荧光(IF)及激光共聚焦方法(Confocal)观察自噬体及蛋白共定位等;采用流式细胞仪(Flow cytometry)检测细胞凋亡及ROS。结果BBM可明显增加乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞中自噬小体的数量:增加自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ的表达,但不影响促进自噬体形成的关键蛋白的表达。tfLC3双荧光质粒转染实验,确证BBM阻断了乳腺癌细胞的自噬降解。IP及Confocal研究发现BBM既不破坏溶酶体的酸性环境也不降低溶酶体膜标志蛋白LAMP1/LAMP2的表达,但可抑制自噬体与溶酶体的融合。进一步研究发现BBM可干扰SNAP29-VAMP8之间的结合,影响了自噬体-溶酶体融合所必需的SNARE蛋白复合物的形成,从而抑制自噬体-溶酶体的融合而阻断自噬降解。研究也发现BBM可以增加BNIP3的mRNA转录水平及上调BNIP3蛋白的表达;采用shRNA干扰的方法敲降BNIP3后,可减轻BBM对SNAP29-VAMP8结合的干扰,减弱BBM对自噬体-溶酶体融合的抑制作用进而削弱BBM阻断自噬降解的作用。而通过Co-IP实验发现BNIP3与SNAP29可以发生共沉淀,IF检测发现BNIP3可以与SNAP29发生共定位;而过表达SNAP29可以减轻BNIP3对SNAP29-VAMP8结合的干扰,促进自噬体-溶酶体融合,最终削弱BNIP3阻断自噬降解的作用。MTT检测发现BBM可以抑制不同类型肿瘤细胞的增殖活性,也可协同增敏多种抗肿瘤药物的抗乳腺癌细胞作用;其中对多柔比星(DOX)的增敏作用最强;流式细胞和Western blot检测发现BBM联用DOX (BBM+DOX)可增加乳腺癌细胞的凋亡率,激活细胞凋亡途径;进一步的分子机制研究发现BBM+DOX是通过抑制自噬降解导致自噬体大量堆积,从而协同多柔比星诱导细胞出现氧化应激反应产生ROS,进而影响p38、ERK等MAPK信号通路蛋白的磷酸化水平而激活细胞凋亡途径,促进乳腺癌细胞发生凋亡而抑制其增殖活性。结论盐酸小檗胺是一新型的自噬降解抑制剂,可作为一种新的抗肿瘤药物增敏剂用于抗乳腺癌治疗。
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