论文部分内容阅读
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的中枢神经退行性疾病,其主要病理特点为中脑黑质致密部(Substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺(Dopamine,DA)能神经元变性死亡缺失。氧化应激和线粒体功能障碍已被广泛认为是PD发病的主要病理机制。目前,由于病因及发病机制不明确导致PD的临床治疗主要为对症治疗,但是不能阻止或延缓PD的进程,而且缺乏有效保护DA能神经元的药物。肌细胞增强因子2(Myocyte enhancer factor 2,MEF2)首先在肌细胞的分化研究中发现,其不同亚型(包括MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D)在控制细胞增殖、分化、形态、生存和凋亡中发挥中心作用。而MEF2D已被证实与神经元的分化和存活密切相关,并在DA能神经元的存活中发挥关键作用。进而研究发现,MEF2D可在线粒体中表达,降低线粒体MEF2D表达水平会明显抑制线粒体呼吸链复合体I(简称线粒体复合体I)的功能而诱发神经元死亡,而过表达线粒体靶向MEF2D则可以抵御神经毒素诱发的DA能神经元死亡。线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mt DNA)是线粒体中的遗传物质,也是细胞核外唯一具有遗传效应的物质。线粒体复合体I的46个亚基中,7个亚基由mt DNA编码,其余的39个由核基因编码并导入至线粒体中,然后与mt DNA编码的亚基进行组装。NADH脱氢酶(NADH dehydrogenase,ND)是编码线粒体复合体I的必要组成部分,仅ND6是由L链编码的蛋白,而其余6个亚基则由H链编码。线粒体中的MEF2D可直接与ND6的MEF2位点结合以调节其转录,进而调控线粒体复合体I活性和线粒体的功能,该位点发生突变则会干扰线粒体复合体I的形成。因此,MEF2D-ND6通路可能是一个潜在治疗PD的靶点。红景天苷(Salidroside,Sal),又名2,4-羟基苯乙基-β-D-葡萄糖苷,是传统中草药红景天的主要活性成分之一。药理学研究表明,Sal具有强大的抗氧化特性,而且在抗炎症、抗缺氧和抗凋亡等方面亦发挥作用。我们前期研究发现,Sal可以改善MPTP诱导的PD小鼠的行为协调能力,提高TH阳性神经元的存活数量,并增加DA含量。而且,Sal还可以通过抑制线粒体凋亡途径的激活和调节细胞凋亡因子,以及调节ROS-NO通路、PI3K/Akt通路和激活Nrf2以减轻MPP~+诱导的细胞凋亡。本实验旨在探讨Sal是否能通过调节MEF2D-ND6通路防止线粒体复合体I损伤以保护DA能神经元,为临床开发治疗PD的新药提供实验依据。第一部分Sal对MPP~+-PD细胞模型的保护作用目的:建立MPP~+-PD细胞模型,探讨Sal是否在体外减少MPP~+诱导的细胞凋亡。方法:分组处理后,MTT检测细胞活性,乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)细胞毒性检测试剂盒检测细胞毒性,DHE测定超氧化物阴离子(O2—)水平,DCFH-DA测定ROS水平,Mito Tracker测定线粒体形态水平,TMRE测定线粒体膜电位(ΔΨm)水平,线粒体复合体I活性检测试剂盒检测线粒体复合体I活性。结果:MTT检测发现,不同浓度Sal处理对SN4741细胞活性没有显著影响(P>0.05),50μM MPP~+处理24 h(MPP~+组)则使细胞活性下降至IC50水平(P<0.01),Sal+MPP~+组可以显著保护细胞活性至86.7±9.5%(P<0.01)。TUNEL和Annexin V-FITC/PI检测发现,Sal组不增加细胞凋亡率(P>0.05),MPP~+组可使细胞凋亡率增加(P<0.01),而Sal+MPP~+组中Sal预处理后细胞凋亡率减少(P<0.01)。LDH检测发现,Sal组不增加细胞毒性(P>0.05),MPP~+组可使细胞毒性增加(P<0.01),而Sal+MPP~+组则可使细胞毒性减少(P<0.01)。O2—和ROS检测发现,Sal组不增加O2—或ROS水平(P>0.05),MPP~+组可使O2—或ROS水平显著增加(P<0.01),而Sal+MPP~+组则可使O2—或ROS水平减少(P<0.01)。Mito Tracker检测发现,Sal组对线粒体的长度无影响(P>0.05),MPP~+组可使线粒体碎片化,其长度比例降低(P<0.01),而Sal+MPP~+组可使线粒体碎片化减少,长度比例增加(P<0.01)。ΔΨm检测发现,Sal组对ΔΨm无影响(P>0.05),MPP~+组可导致ΔΨm减少(P<0.01),而Sal+MPP~+组可使ΔΨm增加(P<0.01)。线粒体复合体I活性检测发现,Sal组对其活性无影响(P>0.05),MPP~+组可使其活性减少(P<0.01),而Sal+MPP~+组则可使其活性增加(P<0.01)。结论:Sal在MPP~+-PD细胞模型中不仅可以提高细胞活性,抑制细胞凋亡,而且可以稳定线粒体形态和功能,并且具有抗氧化作用。第二部分Sal对MPP~+-PD细胞模型中MEF2D-ND6通路的保护作用目的:建立MPP~+-PD细胞模型,探讨Sal是否在体外可以调节MEF2D-ND6通路。方法:采用荧光素酶报告基因检测MEF2D的转录水平,Westerning Blot方法检测MEF2D和ND6蛋白水平及细胞质、线粒体和细胞核中MEF2D蛋白水平,q PCR检测MEF2D和ND6 m RNA水平,免疫荧光检测MEF2D和线粒体的共定位水平。结果:荧光素酶报告基因检测发现,Sal处理后MEF2D的转录活性未增加(P>0.05),MPP~+处理后MEF2D的转录活性显著降低(P<0.01),而Sal+MPP~+组MEF2D的转录活性显著增加(P<0.01)。Westerning Blot检测发现,Sal处理后MEF2D蛋白水平亦无显著变化(P>0.05),MPP~+组中MEF2D蛋白水平下降(P<0.01),Sal+MPP~+组可保护MEF2D蛋白水平使其增加(P<0.01)。q PCR检测发现,Sal组中MEF2D m RNA无显著改变(P>0.05),MPP~+组中MEF2D m RNA水平下降(P<0.01),而Sal+MPP~+组可保护MEF2D m RNA水平使其增加(P<0.01)。免疫荧光染色和Westerning Blot检测细胞核、细胞质和线粒体分离显示,Sal组对细胞核、细胞质和线粒体的MEF2D蛋白水平无显著改变(P>0.05),MPP~+组处理后细胞质、线粒体和细胞核中MEF2D蛋白下降均较为显著(P<0.01),而Sal+MPP~+组则细胞核、细胞质和线粒体中的MEF2D蛋白水平均显著升高(P<0.01)。Westerning Blot检测发现,Sal组中ND6蛋白水平无显著变化(P>0.05),MPP~+组中ND6蛋白水平显著下降(P<0.01),而Sal+MPP~+组可保护ND6蛋白水平使其增加(P<0.01),但是与正常对照组比较差异仍有统计学意义(P<0.01)。q PCR检测发现,Sal组中ND6m RNA水平无显著变化(P>0.05),MPP~+组中ND6 m RNA水平下降(P<0.01),而Sal+MPP~+组中ND6 m RNA水平则显著增加至2.11±0.37倍,并与MPP~+组和正常对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:Sal在MPP~+-PD细胞模型中可保护MEF2D-ND6通路以抵抗MPP~+的神经毒性。第三部分sh MEF2D和Mt2Ddn后Sal对MPP~+-PD细胞模型的影响目的:建立sh MEF2D和Mt2Ddn模型,观察Sal对MPP~+-PD细胞模型的影响。方法:采用MTT观察细胞活性,Westerning Blot方法检测MEF2D和ND6蛋白变化水平,Mito Tracker测定线粒体形态,线粒体复合体I活性检测试剂盒检测线粒体复合体I活性。结果:sh MEF2D转染后细胞活性与对照组无显著差异(P>0.05)。sh MEF2D+MPP~+组中sh MEF2D转染后可显著增加SN4741细胞对MPP~+的敏感性,MPP~+仅处理12 h则表现为细胞活性降低,MEF2D和ND6蛋白水平下降,线粒体长度减少,线粒体复合体I活性降低(P<0.01)。sh MEF2D+Sal+MPP~+组中sh MEF2D转染后Sal预处理24 h亦不能保护细胞活性、MEF2D和ND6蛋白水平、线粒体长度和线粒体复合体I活性,与sh MEF2D+MPP~+组比较差异无统计学意义(P>0.05)。单纯转染Mt2Ddn后,即将ND6上的MEF2D结合位点阻断后细胞活性即显著下降,而且MEF2D和ND6蛋白水平均显著下降、线粒体长度缩短和线粒体复合体I活性减少(P<0.01)。而Mt2Ddn+Sal组中经Sal处理4 h后细胞活性、MEF2D和ND6蛋白水平、线粒体长度和线粒体复合体I活性均无显著恢复,与Mt2Ddn组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:Sal可能通过MEF2D-ND6通路在MPP~+-PD细胞模型中发挥保护SN4741细胞作用。第四部分Sal对MPTP-PD小鼠模型中MEF2D-ND6通路的保护作用目的:建立MPTP-PD小鼠模型,探讨Sal是否在体内通过调节MEF2D-ND6通路发挥神经元保护作用。方法:随机将40只小鼠随机分为4组,每组10只。爬杆实验用于检测小鼠的肢体运动协调情况,旷场实验评价小鼠的运动能力的变化,免疫荧光染色方法观察SNpc的TH阳性神经元数量,Western Blot检测MEF2D和ND6蛋白水平,线粒体复合体I活性检测试剂盒检测线粒体复合体I活性。结果:爬杆实验中,Sal组小鼠完全调转头的时间(T-turn)和爬到地面的时间(T-LA)时间无显著变化(P>0.05),MPTP组T-turn和T-LA时间均显著增加(P<0.01),而Sal+MPTP组可以显著减少T-turn和T-LA时间(P<0.01)。旷场实验中,Sal组小鼠运动频率和静止时间无显著变化(P>0.05),MPTP组运动频率显著降低,而静止时间增加(P<0.01),而Sal+MPTP组可以显着恢复运动频率,并且减少静止时间(P<0.01)。免疫荧光检测显示,Sal组TH阳性神经元数量无显著变化(P>0.05),MPTP组其数量则显著下降(P<0.01);而Sal+MPTP组可以保护其数量使其增加(P<0.01)。而且,Sal组MEF2D和ND6蛋白水平均无显著变化(P>0.05),MPTP组MEF2D和ND6蛋白水平均显著下降(P<0.01),Sal+MPTP组可以保护MEF2D和ND6蛋白使其增加(P<0.01)。线粒体复合体I活性检测发现,Sal组线粒体复合体I活性无显著变化(P>0.05),MPTP组其活性显著下降(P<0.01),而Sal+MPTP组可以保护其活性使其增加(P<0.01)。结论:Sal在MPTP-PD小鼠模型中可保护MEF2D-ND6通路以发挥保护DA能神经元的作用。