论文部分内容阅读
动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）作为许多疾病的病理基础,是人类死亡的重要原因,对AS发病机制和防治的研究一直是医学探究的热点。早在1999年就有学者提出AS的“炎症学说”,指出AS发生发展过程始终伴随炎症反应。引起AS发生的脂质沉积、内皮细胞损伤、平滑肌细胞增殖等病理改变均涉及多种炎症因子和细胞的参与,炎症因子之间不断相互作用、相互影响促进AS的发生发展。AS时炎症因子的产生、作用由机体严密的炎症调节所掌控,通过信号转导通路影响在炎症中起关键调节作用的基因,改变其下游效应分子的表达及活性,从而参与AS形成。因此,深入研究AS相关炎症信号转导通路或起关键作用的分子,对从炎症角度干预AS疾病具有重要意义。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPKs）存在于所有真核细胞调节过程中,是调控炎症因子、介质激活的主要信号通路。MAPK信号转导途径一旦被激活,对细胞刺激实现多样化的协调和综合响应,控制炎症因子的合成和释放,与AS的发生发展密切相关,抑制该通路激活是很好治疗AS的策略。尾加压素Ⅱ（urotensinⅡ,UⅡ）是目前已知作用最强的缩血管活性物质,与其受体G蛋白偶联受体14（G protein coupled receptor 14,GPR14）结合构成UⅡ/UT系统,促进AS的发生发展。Urantide来源于人UⅡ片段,被认为是UⅡ特异性受体最有效的拮抗剂。我们前期研究发现,UⅡ与其受体GPR14结合,可激活MAPK信号通路,通过炎症机制参与AS的发生发展;而Urantide则可抑制该通路的激活,阻断UⅡ对AS的促进作用,但具体作用机制尚不清楚。本研究以MAPK信号通路为切入点,应用血清学、形态学、免疫组织化学、qRT-PCR、Western blot等实验技术,研究Urantide对AS大鼠胸主动脉MAPK信号通路的影响,探讨其抑制MAPK信号通路的作用机制,为AS的临床治疗提供新的方向。目的:探讨Urantide对AS大鼠MAPK信号通路的抑制作用及机制,旨在阐明Urantide抗AS作用靶点与抑制MAPK信号通路蛋白级联相关,为Urantide治疗AS提供新思路。方法:1.每组大鼠饲以高脂饮食,并联合腹腔注射维生素D3（VD3）3 d,建立AS大鼠模型。180只Wistar大鼠随机分为:正常对照组（NC）、模型组（AS）、辛伐他汀组、Urantide 3 d、7 d、14 d组。实验前、用药前及实验结束时进行体重称量。2.全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中钙(Ca2+)、甘油三酯（Triglyceride,TG）、总胆固醇（Total cholesterol,TC）以及低密度脂蛋白（Low density lipoprotein,LDL）和高密度脂蛋白（High density lipoprotein,HDL）水平。3.HE染色观察各组大鼠胸主动脉病理变化。4.免疫组织化学染色技术观察Urantide对各组大鼠胸主动脉中p38、JNK、ERK表达情况的影响。5.免疫荧光染色技术观察各组大鼠胸主动脉pp38、pJNK和pERK的表达。6.实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术用于检测Urantide对各组大鼠胸主动脉p38、JNK和ERK mRNA表达的影响。7.蛋白质印迹（Western blot）分析技术用于检测Urantide对大鼠胸主动脉中p38、pp38、JNK、pJNK、ERK和pERK蛋白表达的影响。8.使用SPSS 19.0软件进行统计学分析,数据表示为平均值±标准偏差（x±s）。单因素方差分析对组间差异进行统计学检验,最小显著差法（LSD-t检验）对两两组间比较进行检验。P<0.05表示差异有统计学意义。结果:1.AS组大鼠与正常对照组相比给药前体重明显降低（P<0.01）。各给药组大鼠与AS组相比给药后体重有不同程度的增加（P<0.05或P<0.01）。2.血清学结果显示:AS组血清中Ca2+、TC、TG和LDL水平明显高于正常对照组（P<0.01）,HDL水平明显降低（P<0.01）。Urantide组大鼠与AS组相比,血清中Ca2+、TG以及TC和LDL水平降低（P<0.05或P<0.01）,HDL水平升高（P<0.05或P<0.01）。3.HE染色结果显示:AS组大鼠胸主动脉发生典型的AS病变,而Urantide各给药组随着给药时间的延长胸主动脉AS病变程度逐渐减轻。4.免疫组织化学染色结果显示:AS组胸主动脉p38、JNK和ERK阳性染色与正常对照组相比明显增加（P<0.01）。随着给药时间的延长,Urantide使各组大鼠胸主动脉p38、JNK和ERK的表达与AS组相比逐渐降低（P<0.01）。5.免疫荧光染色结果显示:pp38、pJNK及pERK在正常对照组大鼠胸主动脉中略有表达。AS组与正常对照组相比,pp38、pJNK和pERK在大鼠胸主动脉中表达明显增加（P<0.01）。Urantide可明显降低大鼠胸主动脉pp38、pJNK和pERK的表达,达到或接近于阳性药组的水平（P<0.01）。6.实时荧光定量PCR结果显示:AS组胸主动脉p38、JNK和ERK基因的表达均明显高于正常对照组（P<0.01）。与AS组相比,随着给药时间的延长,p38、JNK及ERK的基因表达在各给药组大鼠胸主动脉中呈下降趋势（P<0.01）。7.免疫印迹结果显示:AS组胸主动脉中p38、pp38和JNK、pJNK、ERK及pERK的蛋白表达均显著高于正常对照组（P<0.01）。各给药组大鼠胸主动脉p38、pp38、JNK、pJNK、ERK以及pERK的蛋白表达与AS组比较均明显降低（P<0.05或P<0.01）。结论:1.Urantide可降低AS大鼠血清中Ca2+、TG、TC和LDL水平,升高HDL水平;并随着给药时间的延长胸主动脉AS病变程度逐渐减轻,大鼠AS症状缓解。2.Urantide下调胸主动脉p38、JNK、ERK mRNA和蛋白磷酸化的表达水平,对AS大鼠胸主动脉有抗炎症损伤作用。