烟曲霉V-ATPasa亚基C的生物学功能和特征研究

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烟曲霉是一种可以产生大量孢子进行繁殖和进行侵袭性生长的主要的人类条件致病真菌。尽管研究烟曲霉具有重要的医学和生态学意义,人们也已经建立了完善的烟曲霉遗传体系,但仍有许多基因的功能尚未被探究。V-ATPase是一个保守的多亚基复合物,由定位于细胞质内的V1结构域和质膜上的V0结构域组成,V1结构域负责水解ATP提供能量,而V0结构域则负责质子转运。vmaC编码的蛋白是V-ATPase V1结构域的C亚基,而C亚基对于V-ATPase的组装是必需的。本论文主要探究了 vmaC在烟曲霉中的功能。首先通过同源重组技术构建△vmaC菌株,并结合离子液相色谱和实时定量PCR技术分析敲除菌株细胞壁各组分,△vmaC菌株菌丝极性生长丢失,无分生孢子产生,液泡酸性丢失,细胞壁改变且几丁质分布紊乱,说明烟曲霉vmaC是菌丝生长、产孢、液泡功能和细胞壁合成所必需的。进一步将水母发光蛋白转入对应菌株构建活体测钙菌株检测各细胞器钙离子的动态变化,在外界高钙压力刺激下,vmaC敲除菌株细胞质和液泡对钙离子的响应相比于对照菌株均表现出明显差异,说明V-ATPase参与体内钙离子平衡。利用免疫共沉淀结合质谱的检验技术确定VmaC蛋白是V-ATPase的组成部分。构建烟曲霉vmaC自身启动子调控下的AnvmaC和ScvmaC的异源回补菌株发现,异源回补菌株弥补了条件菌株的缺陷表型;敲除VmaC蛋白C末端疏水结构域菌株表型与野生型类似,略微影响菌丝生长和产孢,与酿酒酵母中报道不同。说明烟曲霉中VmaC蛋白在真菌V-ATPase功能中是保守的,但保守结构域的重要性却存在差别。综上所述,本研究的研究结果表明烟曲霉中VmaC蛋白是菌丝生长和产孢所必需的,它也许可以成为新的抗烟曲霉的药物靶点。
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