研究背景与目的食管癌(esophagus cancer,EC)位居世界常见恶性肿瘤第8位,是一类以高发病率、高致死率著称的恶性肿瘤,食管癌死亡率位居世界常见恶性肿瘤死亡率第6位,全球每年大约有30万人死于食管癌。在中国,食管癌发病率位于恶性肿瘤发病率的第5位,每年约有15万人因食管癌而丧命。中国食管癌的病理分型主要以食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)为主。由于食管癌的发生是一个多因素的过程,以及食管癌恶性发生、预后差、生存率低等特性,使得食管癌的临床诊断、治疗等方面难上加难。围绕食管鳞癌发生发展等基础研究,各研究团队从基因组学、蛋白组学等方面对食管鳞癌展开了全面研究,如食管鳞癌发生发展相关遗传基因的筛选,lncRNA、miRNA、甲基化等表观遗传调控的研究,食管鳞癌发生发展相关蛋白分子以及临床治疗生物靶标分子的筛选等方面的研究。但是,这些研究在诊断以及治疗方面的可行性以及有效性仍然不尽人意。因此,寻找食管鳞癌更为有效、可行的诊断靶标分子以及分子治疗靶点是目前各方努力的焦点之一。细胞周期素依赖性激酶16(cyclin-dependent kinase 16,CDK16),又称为PCTAIRE1,是细胞周期素依赖性激酶家族成员之一,CDK16的早期研究发现其主要的生理作用是参与囊泡运输,神经突触的生长以及精子生成,随着对其研究的不断深入,逐渐发现CDK16在肺癌、卵巢癌、肝癌等实体瘤细胞中的高表达能够使肿瘤细胞的细胞周期发生异常调控、增殖能力增强、凋亡能力减弱以及肿瘤细胞放疗耐受等。研究发现CDK16可以与p53和p27相互作用,进而促进肿瘤发生进展。这些证据表明CDK16可能与肿瘤的发生发展存在一定的关系。因此,CDK16在肿瘤中存在何种具体调控机制是一个新的视角。课题组对食管鳞癌相关基因的前期筛选工作中,针对CDK家族成员运用数据库进行大范围筛选,以及免疫组化实验数据初步显示CDK16可能在食管鳞癌的发生进展中发挥作用,并且通过相关文献研究发现,有关CDK16在食管癌中的研究尚未见相关报道。为了进一步深入了解CDK16在食管鳞癌发生发展过程中的作用,课题组首先探讨了 CDK16在食管鳞癌病理组织中的表达以及其临床特征的关系;继而对CDK16是否参与食管鳞癌细胞的生长,增殖以及迁移等细胞生物学过程进行了探讨;最后,通过生物信息学分析的方法对CDK16可能相互作用的蛋白进行预测。本研究从新的角度探索食管鳞癌的发病机制,为食管鳞癌的临床诊断和治疗等提供相关依据。研究方法第一部分CDK16在食管癌中的表达及其与食管癌临床病理特征之间的关系1.采用cBioPortal数据库主要分析食管癌中CDK16 mRNA表达情况,以及CDK16基因在食管癌组织基因突变情况。2.采用免疫组化实验检测在食管鳞癌组织与癌旁组织中CDK16蛋白表达变化,采用卡方检验分析CDK16蛋白与食管鳞癌病例组织病理特征之间的关系。第二部分CDK16敲低对食管鳞癌细胞生长,增殖及迁移的影响1.采用 RT-PCR 技术、Western Blot 技术检测EC-1、Eca-109、TE-1、KYSE-30、KYSE-150、KYSE-450、KYSE-510七种食管鳞癌细胞株以及N1217正常食管上皮细胞中的CDK16 mRNA以及蛋白的表达水平,筛选CDK16 mRNA以及蛋白相对正常食管上皮细胞高表达的细胞株。2.采用CDK16 siRNA瞬时转染,敲低EC-1、KYSE-510两个细胞中CDK16,进而研究CDK16基因敲低对食管鳞癌生长、增殖以及迁移的影响。我们将细胞分为EC-1-NC对照组、EC-1-siRNA干扰组以及KYSE-510-NC对照组、KYSE-510-siRNA干扰组。分别用CCK-8法、MTT法检测各组细胞生长、增殖的变化,用划痕实验、Transwell实验检测各组细胞迁移能力的变化。第三部分利用生信分析预测与CDK16相互作用蛋白1.选用 STRING、UniHi、IntAct、HitPredict及 genemania五个数据库,初步筛选出可能和CDK16相互作用的蛋白,通过构建VENN图的方法第二次筛选在两个及两个以上数据库共同筛选得到的CDK16相互作用蛋白。2.采用DAVID工具对筛选的结果进行GO富集分析以及KEGG富集分析,进行CDK16靶蛋白再一次筛选(P<0.05)。3.采用STRING数据库对筛选蛋白进行分析,建立蛋白之间的互作关系。采用Cytoscape软件中建立PPI网络图。最终,采用MCC算法从差异基因中筛选出显著的关键基因进行下一步分析。4.最终利用数据库分析最为显著的关键基因在食管癌组织和正常食管组织中的表达差异。结果1.cBioPortal结果显示,在185例食管癌病例中,存在8%(15例/185例)的病例样本中CDK16基因发生变化,其中主要以CDK16mRNA上调为主。2.免疫组化结果显示在食管鳞癌组织中CDK16蛋白表达水平明显高于癌旁组织,并且在CDK16蛋白表达水平与病理特征之间关系的分析中发现,CDK16在食管鳞癌组织中的高表达与其分化程度、淋巴结转移、TNM分期之间存在关联。3.CDK16在EC-1、Eca-109、TE-1、KYSE-150、KYSE-450、KYSE-510 食管鳞癌细胞株中的表达水平明显高于N1217正常食管上皮细胞。且在KYSE-510、EC-1两株食管鳞癌细胞中CDK16表达水平相对较高。4.选用KYSE-510、EC-1两株细胞使用CDK16 siRNA瞬转,敲低CDK16表达水平之后,细胞生长、增殖以及迁移的能力受到了抑制。5.通过生信分析筛选出YWHAH、YWHAZ、YWHAG、YWHAB、YWHAE、YWHAQ、XPO1、PPP2R2A、KSR1 及 HDAC4 等十个可能与CDK16相互作用的蛋白。6.通过生信分析发现YWHAH以及XPO1在食管鳞癌组织中的表达水平相较于正常食管组织存在差异。结论1.CDK16在食管鳞癌组织以及食管鳞癌细胞中均呈现较高水平表达。2.CDK16能够促进食管鳞癌细胞生长,增殖以及迁移。3.生物信息学分析显示,CDK16可能与YWHAH、XPO1蛋白发生互作,进而对食管鳞癌的发生进展产生影响。