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第一部分MM-BMSC对CD4+T细胞的免疫负调节作用目的:在体外探讨MM-BMSC对CD4+T细胞增殖,凋亡,衰老和分化的影响。方法:收集20例初诊多发性骨髓瘤患者和20例正常人骨髓血标本各lml,体外采用人间充质干细胞培养基(premedics)培养骨髓血3周,EDTA-胰酶消化获取BMSC,流式细胞术鉴定BMSC表面CD34,CD45,CD90,CD105的表达,同时采用磁珠分选试剂盒(Stem cell)从正常人外周血单个核细胞中提取CD4+T细胞,以BMSC:T细胞=1:5的比例接种于12孔板中,实验设置为HD-BMSC,MM-BMSC共培养组,活化T细胞组,未活化T细胞组,共培养6天后收集上清中的T细胞。采用cck-8法检测BMSC接触共培养CD4+T细胞增殖的变化;采用Annexin V FITC/PI双染法流式细胞术检测BMSC对CD4+T细胞凋亡的影响;采用β-gal试剂盒(lifetech)染色衰老标志β-半乳糖苷酶以评估共培养CD4+T细胞衰老程度的变化,并以FITC-CD4及PE-CD28荧光标记抗体(BD)结合共培养T细胞流式细胞术检测其T细胞活化分子CD28表达的变化,同时PCR法检测端粒酶催化亚单位人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)的水平,综合分析 BMSC 对 CD4+T 细胞衰老的影响;采用 FITC-CD4,PE-IL-17,Percpy5.5-CD25,and 647-Foxp3 抗体(BD)标记共培养T细胞流式细胞术检测BMSC对Treg/Th17的影响,并通过PCR法检测对应的转录因子Foxp3和RORλt的水平,以及ELISA试剂盒(ebioscience)检测相应标志性细胞因子IL-10和IL-17的分泌水平,评价BMSC对CD4+T细胞Treg和Th17分化的作用。结果:(1)BMSC高表达CD90和CD105,低表达CD34与CD45;(2)以CD3功能性抗体活化的T细胞增殖为基准,HD-BMSC与MM-BMSC均明显抑制共培养CD4+T细胞增殖,而共培养两组之间无统计学差异;(3)HD-BMSC共培养组和MM-BMSC共培养组CD4+T细胞凋亡水平无明显变化;(4)取不同视野下蓝染细胞(衰老细胞)百分比平均值以评价细胞衰老程度,与活化T细胞组衰老程度相比,HD-BMSC与MM-BMSC均明显上调细胞衰老比例,其中MM-BMSC促进衰老的效果更为显著;(5)HD-BMSC与MM-BMSC均下调共培养CD4+T细胞CD28的表达水平,MM-BMSC抑制CD28表达的作用更为显著;(6)PCR检测到BMSC下调CD4+T细胞hTERT的表达水平,而与HD-BMSC组相比,MM-BMSC可以显著下调hTERT的水平;(7)HD-BMSC共培养组的CD4+T细胞中Treg/Th17明显向Treg漂移,伴随着IL-10水平的上调,MM-BMSC共培养组的CD4+T细胞中Treg/Th17向Th17漂移,同时伴有IL-10和IL-17水平的上调,其中尤以IL-17为显著;(8)PCR的结果显示MM-BMSC主要表现为RORyt的诱导作用,而HD-BMSC主要表现为Foxp3的诱导作用。结论:MM-BMSC对CD4+T细胞具有明显的免疫负调控作用:抑制T细胞增殖;显著促进T细胞衰老,同时诱导T细胞向Th17分化,上调IL-17的水平,从而诱导免疫耐受和免疫逃逸。第二部分FAP α在BMSC中的表达和分布特点目的:研究FAPα在BMSC中的表达和分布特点。方法:用兔抗人FAPα单克隆抗体结合BMSC,采用免疫荧光方法在显微镜下观察BMSC中FAPα的分布;采用Western blot方法检测BMSC提取蛋白中FAPα的表达量;采用RT-PCR检测BMSC中FAPα的水平。结果:(1)在显微镜下可见HD-BMSC和MM-BMSC细胞表面表达FAPα;(2)用Western blot方法和RT-PCR方法均显示FAPα的表达量在两组之间并没有统计学差异,我们推测由于BMSC缺乏多发性骨髓瘤微环境的刺激而导致FAPα的表达量在两组之间没有明显差异,所以我们在BMSC培养基中加入U266细胞培养上清(Tumor cells cultured medium,TCCM)以模拟肿瘤微环境,通过Western blot方法观察到TCCM处理后的MM-BMSC中FAPα的表达量明显上调。结论:BMSC细胞表面表达FAPα,肿瘤微环境诱导MM-BMSCs高表达FAPα。第三部分FAP α在MM-BMSC负性调节T细胞中的关键作用目的:研究以PT-100抑制FAPα后MM-BMSC对T细胞功能的负性调控作用的影响。方法:收集10例初诊多发性骨髓瘤患者和10例正常人骨髓血标本各1ml,体外采用人间充质干细胞培养基(premedics)培养骨髓血3周,EDTA-胰酶消化获取BMSC,同时采用磁珠分选试剂盒(Stem cell)从正常人外周血单个核细胞中提取CD4+T细胞,以BMSC:T细胞=1:5的比例接种于12孔板中,实验设置为HD-BMSC,MM-BMSC共培养组,活化T细胞组,分别以1pmol/mL,0.1pmol/mLPT-100处理,共培养6天后收集上清中的T细胞。采用cck-8法检测各组CD4+T细胞增殖的变化;采用β-gal试剂盒(lifetech)染色衰老标志β-半乳糖苷酶以评估共培养CD4+T细胞衰老程度的变化,并以FITC-CD4及PE-CD28荧光标记抗体(BD)结合共培养T细胞流式细胞术检测其T细胞活化分子 CD28表达的变化,同时PCR法检测端粒酶催化亚单位人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)的水平,综合分析PT-100抑制FAP α功能后,BMSC对CD4+T细胞衰老促进作用的变化;采用FITC-CD4,PE-IL-17,Percpy5.5-CD25,and 647-Foxp3抗体(BD)标记共培养T细胞流式细胞术检测PT-100处理后各组Treg/Th17的情况,并通过PCR法检测对应的转录因子Foxp3和ROR λ t的水平,以及ELISA试剂盒(ebioscience)检测相应标志性细胞因子IL-10和IL-17的分泌水平,评价PT-100抑制FAP α后,BMSC对CD4+T细胞Treg和Th17分化调节作用的改变。结果:(1)1pmol/mL,0.1pmol/mLPT-1 00 处理后 HD-BMSC 与 MM-BMSC 共培养 CD4+T细胞增殖能力较相应未处理组明显上调,而PT-100对单独培养的CD4+T细胞增殖没有影响。(2)1pmol/mL,0.1pmol/mLPT-100 处理后,MM-BMSC 共培养 CD4+T 细胞衰老细胞百分比明显下调,而PT-100对HD-BMSC共培养T细胞的衰老没有明显影响(P>0.05),提示PT-100对MM-BMSC中FAPα的抑制作用更加显著,并逆转了MM-BMSC的T细胞衰老促进作用,从而验证了 FAP α MM-BMSC对T细胞衰老调节中的关键作用。(3)PT-100抑制FAP α后,HD-BMSC与MM-BMSC共培养CD4+T细胞表面CD28表达较未处理组显著上调,其中HD-BMSC共培养T细胞CD28表达恢复至正常活化T细胞水平,MM-BMSC共培养T细胞CD28表达有4-5倍变化,而PT-100对单独培养T细胞CD28表达并无影响,进一步说明BMSC通过FAP α对T细胞起到衰老促进作用。(4)PT-100能上调HD-BMSC和MM-BMSC共培养T细胞hTERT表达,而对T细胞自身hTERT的表达无明显影响。(5)高浓度PT-100,即1pmol/mLPT-100上调BMSC共培养CD4+T细胞Treg/Th17比值,PT-100对单独培养的T细胞Treg/Th17无明显作用。同时1pmol/mLPT-100虽上调HD-BMSC共培养组T细胞Foxp3的表达水平,但RORyt的PCR结果显示,PT-100主要下调RORyt的表达,即抑制Th17分化影响Treg/Th17比值。(6)PT-100下调MM-BMSC共培养T细胞IL-17分泌,而对其他组IL-10分泌无明显影响。结论:MM-BMSC通过FAP α负性调控CD4+T细胞,PT-100结合FAP α活性位点抑制其功能,从而上调T细胞增殖能力,上调活化标志CD28和端粒酶hTERT的表达,从而降低T细胞衰老程度,主要通过抑制RORγt的表达促进Treg/Th17向Treg漂移。第四部分FAPα在MM-BMSC免疫负调控中的作用机制目的:探讨MM-BMSC/FAP α的免疫负调控作用与经典细胞生长调控通路PI3K/AKT之间的关系,研究MM-BMSC/FAP α对下游细胞因子转化生长因子(transformation growth factor,TGF-β)表达水平的调节作用。方法:采用Western blot方法检测PT-100处理前后MM-BMSC共培养T细胞中AKT和p-AKT表达量的改变;取MM-BMSC与分选的CD4+T细胞以1:5的比例共培养,实验设置为MM-BMSC共培养组,CD4+T细胞组,通过25μmol/mL和50μmol/mLPI3K通路抑制剂LY294002阻断该通路的下游功能或者对照处理,采用ELISA试剂盒检测各组TGF-β,IL-17的水平;采用RT-PCR比较各组RORγt和hTERT的表达水平;采用流式细胞术分析各组T细胞CD28的表达水平。采用Westen blot检测PT-100处理对MM-BMSC中TGF-β表达量的影响;以BMSC:T细胞=1:5的比例接种于12孔板中,实验设置为HD-BMSC,MM-BMSC共培养组,活化T细胞组,分别以1pmol/mL,0.1pmol/mLPT-100处理,ELISA试剂盒检测P-100对各组T细胞分泌TGF-β水平的影响。结果:(1)MM-BMSC共培养处理的CD4+T细胞p-AKT的表达水平较活化T细胞组升高,而1pmol/mLPT-100处理后p-AKT的水平明显下调。(2)LY294002阻断PI3K/AKT通路能够下调MM-BMSC共培养上清中TGF-β的水平,而不会直接影响T细胞TGF-β的水平。(3)阻断PI3K/AKT通路能上调MM-BMSC共培养T细胞CD28的表达,达到与正常活化T细胞同水平,并明显上调hTERT的表达,不影响单独活化T细胞的衰老。(4)50μmol/mLLY294002处理的共培养T细胞RORyt的表达量下调并伴随 IL-17 水平的下降。(5)1pmol/mLPT-100 处理的 MM-BMSC 中 Western blot检测到TGF-β水平较对照组下降。(6)MM-BMSC共培养上清中的TGF-β水平较活化T细胞明显上调,经过1poml/mLPT-100处理后,其水平显著下调。结论:MM-BMSC/FAPα通过异常活化PI3K/AKT通路上调TGF-β的水平,并诱导衰老和Th17分化,负性调控T细胞。