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目的:孤独症谱系障碍(Autism spectrum disorder,ASD)是一种广泛性神经发育障碍。其病因复杂且致病机制不明,迄今无特效药,主要以行为与教育干预为主。临床研究发现部分ASD患者中具有CACNA1H基因(编码T型钙通道3.2亚型,Ca_v3.2)突变,但缺乏生物学证据和动物模型的验证。环境丰富化(Environment enrichment,EE)通过物理和社交环境刺激脑神经元突触发生,促进大脑活动增加,从而改善ASD患者社交和情绪异常。为进一步明确Cacna1h与ASD的关系,本实验利用Cacna1h基因敲除(KO)小鼠,探究其ASD样行为和机制,并进一步探讨EE干预的效果和机制。方法:1、随机选取幼年56只野生型(WT)与53只KO小鼠、成年62只WT与52只KO小鼠、幼年和成年WT(Thy1~+)与KO(Thy1~+)小鼠各5只,以WT为对照组、KO为实验组进行以下实验:(1)行为学观察:(1)三箱实验评估小鼠的社交能力和对新社交对象识别行为;(2)Y迷宫实验评估小鼠空间工作记忆能力;(3)旷场实验分析小鼠焦虑、重复刻板行为及自发活动;(4)强迫游泳实验观察小鼠抑郁样行为。(2)行为学结束后选取部分同窝小鼠,测量其体重、脑重与脑体积,并通过尼氏染色法观察大脑神经元数目。(3)观察WT(Thy1~+)与KO(Thy1~+)小鼠神经元树突棘情况。2、取生后21天的18只WT及24只KO小鼠、WT(Thy1~+)与KO(Thy1~+)小鼠各5只,放入EE笼中成长至其生后56天,以标准笼(STD)饲养为对照组、EE饲养为实验组评估EE干预对小鼠的影响。结果:1、(1)三箱实验:与WT小鼠相比,在社交测试阶段,幼年(0.62±0.07 vs 0.50±0.10)和成年(0.46±0.07 vs 0.47±0.05)KO小鼠对陌生鼠的探索偏好均无显著差异;但在对新社交对象识别测试阶段,幼年(0.52±0.05 vs 0.15±0.15)和成年(0.37±0.07 vs 0.17±0.07)KO小鼠对新陌生鼠的探索偏好均显著减少。(2)Y迷宫实验:与WT小鼠相比,幼年(0.57±0.02 vs 0.51±0.04)及成年(0.56±0.02 vs 0.59±0.03)KO小鼠自发交替均无显著差异;幼年WT与KO小鼠进入臂的总次数无显著差异(26±2次vs 25±3次),而成年KO小鼠显著多于WT小鼠(28±2次vs 41±3次)。(3)旷场实验:与WT小鼠相比,幼年和成年KO小鼠在旷场中心活动时间均更少(幼年:53.87±6.01 s vs 36.30±3.63 s;成年:67.51±6.92 s vs 46.93±4.12 s),自梳理时间(幼年:69.86±13.53 s vs131.66±24.92 s;成年:17.52±5.18 s vs 46.06±6.02 s)及总运动路程(幼年:12 837.82±687.70 cm vs 15 304.49±769.02 cm;成年:15 779.61±721.08 cm vs19 020.03±1449.29 cm)均更多。(4)强迫游泳实验:与WT小鼠相比,幼年(0.19±0.19 s vs 0.67±0.45 s)及成年(32.06±12.87 s vs 29.83±16.70 s)KO小鼠在游泳缸中不动的时间均无显著差异。2、幼年和成年KO小鼠体重(幼年:7.05±0.97 g vs 7.43±0.99 g;成年:16.64±0.66 g vs 18.56±0.93 g)、脑重与体重比(幼年:0.06±0.00 vs 0.06±0.01;成年:0.03±0.00 vs 0.02±0.00)与脑体积(幼年:0.39±0.00 m L vs 0.40±0.01m L;成年:0.43±0.02 m L vs 0.43±0.03 m L)较同龄WT小鼠无显著差异。尼氏染色:幼年KO小鼠内侧前额叶皮层(m PFC)(第Ⅱ/Ⅲ层:1.00±0.03 vs 0.87±0.03;第Ⅴ层:0.98±0.04 vs 0.89±0.05;第Ⅵ层1.00±0.05 vs 0.84±0.05)、海马齿状回(DG)(1.00±0.03 vs 0.86±0.05)及基底外侧杏仁核(BLA)区(1.00±0.06 vs 0.82±0.04)神经元数目比同龄WT小鼠更少,而成年期无显著差异(m PFC第Ⅱ/Ⅲ层:1.00±0.12 vs 0.98±0.06;m PFC第Ⅴ层:1.15±0.10 vs 1.09±0.09;m PFC第Ⅵ层:1.00±0.06 vs 0.91±0.06;DG:1.00±0.03 vs 0.99±0.05;BLA:1.00±0.08 vs 0.98±0.05)。3、树突棘密度:幼年KO小鼠DG区(8.32±0.20 vs 10.03±0.69)、成年KO小鼠m PFC(9.88±0.24 vs 12.76±0.43)、DG(9.83±0.24 vs 11.50±0.71)及BLA(10.65±0.32 vs 12.52±0.68)区均比WT小鼠更高;树突棘成熟度:幼年(m PFC:37.80±2.48 vs 40.40±2.50;DG:34.40±1.03 vs 39.60±2.48;BLA:36.20±1.62 vs 39.00±2.70)及成年(m PFC:57.20±3.81 vs 68.80±4.07;DG:53.40±3.50 vs 62.50±5.39;BLA:59.00±3.61 vs 64.00±3.99)KO小鼠与WT相比均无显著差异。4、EE干预后行为学测试:三箱实验中,EE使KO小鼠对陌生鼠和新陌生鼠的探索偏好均明显增加(0.47±0.05 vs 0.64±0.06;0.36±0.08 vs 0.40±0.07)。旷场实验中,EE干预后KO小鼠在旷场中心活动时间无明显变化(46.93±4.12 s vs 43.76±8.52 s),而WT小鼠减少(67.51±6.92 s vs 44.82±8.72 s);KO小鼠自梳理时间(46.06±6.02 s vs 43.67±12.11 s)及总运动路程(19 020.03±1449.29cm vs 18 404.39±1494.10 cm)均无明显改变。5、EE干预后树突棘密度:EE干预后KO小鼠m PFC(12.76±0.43 vs 12.14±1.07)及BLA区(12.52±0.68 vs 13.60±0.50)无明显变化,但WT小鼠显著增加(m PFC:9.88±0.24 vs 11.30±0.36;BLA:10.65±0.32 vs 13.04±0.63);WT和KO小鼠DG区均无明显改变(WT:9.83±0.24 vs 10.88±1.10;KO:11.50±0.71 vs 11.38±0.60)。树突棘成熟度:EE干预后KO小鼠m PFC区增加(68.80±4.07 vs 70.00±3.51),而DG(62.50±5.39 vs 64.00±2.98)和BLA区(64.00±3.99 vs 62.20±5.18)均无显著变化。结论:本研究证实了Cacna1h基因缺失可引起小鼠出现ASD样行为,可能与m PFC、DG及BLA区神经元数目减少及树突棘密度增加有关;EE干预可改善KO小鼠的部分ASD样行为,可能与增强树突棘功能有关。本研究结果将促进对ASD的遗传机制的理解,并为以Cacna1h基因为靶点的药物开发提供理论依据。