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第一部分细胞水平上验证TGFβ1/Smad信号通路对DNA-PKcs的表达影响及机制研究[目的]本研究为了明确DNA-PKcs与TGFβ1/Smad信号通路存在相互作用,因此在结合课题组前期研究的基础上,在细胞水平探讨TGF-β1/Smad对DNA-PKcs活化水平的影响。[方法]1.本实验细胞选用SCL-1鳞癌细胞株,首先选择TGF-β1/Smad信号通路上游因子TGFβRⅠ作为目的基因,转染SCL-1细胞,从上游阻断通路表达,此为实验组Si-TGFβR Ⅰ;转染内参至正常SCL-1,此为对照组Si-NC;然后进行CCK8细胞增殖检测法、EdU检测试验、细胞划痕实验来分别检测实验组和对照组细胞的细胞活力、细胞增殖情况、细胞迁移能力等;采用实时荧光定量PCR技术检测转染目的基因TGFβR Ⅰ的SCL-1鳞癌细胞中DNA-PKcs基因的表达情况;采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测转染目的基因TGFβR Ⅰ的SCL-1鳞癌细胞中DNA-PKcs表达及活化水平。2.选择TGF-β1/Smad信号通路下游因子Smad3转染SCL-1细胞,从下游阻断通路表达,此为实验组Si-smad3;转染内参至正常SCL-1,此为对照组Si-NC;然后进行CCK8细胞增殖检测法、EdU检测试验、细胞划痕实验来分别检测实验组和对照组细胞的细胞活力、细胞增殖情况、细胞迁移能力等;采用实时荧光定量PCR技术检测转染目的基因Smad3的SCL-1鳞癌细胞中DNA-PKcs基因的表达情况;采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测转染基因Smad3的SCL-1在鳞癌细胞中DNA-PKcs表达及活化水平。[结果]1.si-TGFβR Ⅰ和si-GAPDH转染的SCL-1细胞在培养24小时后,CCK8检测结果显示,实验组细胞活性减少,增殖能力减弱,结果具有统计学意义(P<0.05);si-smad3和si-GAPDH转染的SCL-1细胞在培养24小时后,CCK8检测结果显示,实验组细胞活性减少,增殖能力减弱,结果具有统计学意义(P<0.05)。2..si-TGFβR Ⅰ和si-GAPDH转染的SCL-1细胞EDU检测试验结果显示实验组SCL-1增殖减少(P<0.05),结果具有统计学意义;si-smad3和si-GAPDH转染的SCL-1细胞EDU检测试验结果显示实验组SCL-1增殖减少(P<0.05),结果具有统计学意义。3.si-TGFβR Ⅰ和si-GAPDH转染的SCL-1细胞的细胞划痕实验结果显示细胞迁移能力实验组比对照组稍微降低,但结果无明显统计学差异(P>0.05);si-smad3和si-GAPDH转染的SCL-1细胞的细胞划痕实验结果显示细胞迁移能力实验组比对照组稍微降低,但结果无明显统计学差异(P>0.05)。4.si-TGFβR Ⅰ和si-GAPDH转染的SCL-1细胞的PCR结果显示实验组与对照组比较,DNA-PKcs基因表达升高,结果具有统计学意义(P<0.05);si-smad3和si-GAPDH转染的SCL-1细胞PCR结果显示实验组与对照组比较,DNA-PKcs基因表达降低,结果具有统计学意义(P<0.05)。5.si-TGFβR Ⅰ和si-GAPDH转染的SCL-1细胞蛋白的Western Blot结果显示DNA-PKcs和P-DNA-PKcs的表达在实验组的SCL-1细胞中的表达增高,此Western Blot结果与前面的PCR表达结果相同,且有统计学意义(P<0.05);si-smad3和 si-GAPDH转染的 SCL-1 细胞蛋白的 Western Blot结果显示DNA-PKcs的表达在实验组的SCL-1细胞中轻微降低,P-DNA-PKcs的表达无明显差异,且结果都无统计学意义(P>0.05)。[结论]1.TGFβ1/Smad信号转导通路在鳞癌细胞中主要作用还是促进癌细胞的增殖;2.TGFβ1/Smad的上游因子TGFβR Ⅰ对DNA-PKcs的表达及活化起抑制作用;3.TGFβ1/Smad的下游因子Smad3对DNA-PKcs的表达及活化无明显作用。第二部分动物水平验证DNA-PKcs在紫外线照射下对两条通路表达的影响[目的]本研究为了进一步明确DNA-PKcs在紫外线诱导下对两条通路的交互作用,故本实验在动物水平探讨DNA-PKcs在长期紫外线照射下对两条通路关键蛋白表达的作用。[方法]1.选用3只基因敲除DNA-PKcs的C57雌性小鼠(6周龄)作为实验组,选择3只正常C57雌性小鼠作为实验组,在相同饲养条件下,定期按照逐渐递增MED值的剂量累积照光12周后处死小鼠,取小鼠背部皮肤,进行后续蛋白检测。2.取出的小鼠背部皮肤提取组织蛋白,选用PIKKs/Akt信号通路的蛋白AKT、P-Akt、S6、P-S6 和 TGFβ1/Smad 信号通路的蛋白 smad3、P-smad3、TGFβR Ⅰ,检测两条通路在长期紫外线照射下,在DNA-PKcs影响下两条通路表达和活化情况。[结果]1.PIKKs/Akt(DNA-PK/Akt)信号通路检测结果:照光12周后,敲除DNA-PKcs基因小鼠的背部皮肤组织蛋白Western Blot检测结果显示该通路的蛋白AKT、P-Akt、S6、P-S6的表达均降低,AKT的活化状态降低,S6的活化状态也降低,结果具有统计学意义(P<0.05)。2.TGFβ1/Smad信号通路检测结果:照光12周后,敲除DNA-PKcs基因小鼠的背部皮肤组织蛋白Western Blot检测结果显示该通路的蛋白Smad3、P-Smad3、TGFβRⅠ的表达均升高,smad3的活化增加,且结果具有统计学意义(P<0.05)。[结论]在紫外线长期照射下,阻断DNA-PKcs表达对延缓鳞癌的发生发展有重要的作用,可为临床药物干预治疗靶点提供新思路。