卵巢上皮性癌(以下简称卵巢癌)是妇女生殖系统常见恶性肿瘤,是死亡率最高的疾病之一。据统计,2006年在美国约有20,180例新发病例,约15,310例死于该病。大多数卵巢癌妇女在初次诊断时已经广泛转移。导致这种不幸的原因是,由于大部分患者不能得到早期诊断。目前,早期诊断的ⅠA期90%及Ⅱ期70%的卵巢癌是可以治愈的。对于疾病发生及发展过程的理解将有助于我们在早期或可治愈阶段识别卵巢癌以及为进展性卵巢癌发展新型、有效的治疗方法。溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPA)在90%卵巢癌患者的腹水及血浆中升高,同时这种升高与临床分期无关,Ⅰ期卵巢癌患者血浆LPA增高近90%,Ⅱ~Ⅳ期及复发性患者血浆LPA增高均达100%。这提示血浆LPA的水平可能成为卵巢癌诊断、预后或监视治疗效果的标志物。LPA促进肿瘤发生发展机制的研究,提示LPA可能通过基因表达的调节促进肿瘤的增殖、生存、侵袭和转移。LPA具有生长因子样作用,通过细胞膜上特异性G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor,GPCR)刺激细胞迁移、增殖、生存、黏附及血管生成因子等的分泌。已知LPA受体有四种,(LPA1/Edg-2,LPA2/Edg-4,LPA3/Edg-7)以及最近识别的GPR23/p2y9/LPA4。正常卵巢上皮细胞中LPA2/Edg-4和LPA3/Edg-7 mRNA低表达,在卵巢癌细胞中高表达;在卵巢癌细胞中LPA2/Edg-4、LPA3/Edg-7的高表达参与调节LPA的自分泌环,而LPA1/Edg-2在卵巢癌细胞LPA的自分泌过程中表现为负性调节作用。提示LPA受体可能成为潜在的治疗靶。卵巢癌发病隐匿,进展迅速,70% ~ 80%的卵巢癌患者发现时已为晚期,5年生存率在30%左右。在近乎所有的卵巢癌患者中,以铂类为基础的化疗是最有效的标准化学治疗。尽管大多数患者在最初的治疗过程中有效,甚至少数患者可以治愈,但随着化疗疗程的延长,最终约有80%的患者出现继发性耐药,铂类耐药是卵巢癌化疗治疗失败的主要原因。顺铂(Cisplatin,DDP)作为卵巢癌治疗的一线化疗药物,其杀伤肿瘤的主要机制是通过诱导细胞凋亡。顺铂能够诱导包括卵巢癌在内的多种肿瘤细胞发生凋亡。研究表明,溶血磷脂酸在不同细胞类型具有促存活或促凋亡的作用,甚至在同一种细胞在不同的作用条件下,可以产生双重的影响。LPA对顺铂诱导的卵巢癌细胞的凋亡究竟是否有影响,是产生协同作用,还是能够拮抗化疗药物诱导凋亡的作用。通过实验发现LPA明显抑制了顺铂诱导的卵巢癌细胞的凋亡。我们推测这可能是LPA拮抗了顺铂诱导的凋亡作用所致。尽管研究发现LPA在许多细胞系具有明显的抗凋亡作用,但其机制尚不明确。因此我们进一步研究了LPA抑制顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡的可能机制。由于LPA通过其特异性受体发挥作用,在此基础研究之前,我们首先观察了LPA受体在人卵巢癌组织中的表达状况及其与顺铂化疗耐药的关系。第一部分卵巢上皮性肿瘤中溶血磷脂酸受体的表达及临床意义目的:探讨三种溶血磷脂酸受体在人体卵巢上皮性肿瘤组织中的表达状况及临床意义,探讨LPA受体在人卵巢癌组织中的表达状况及其与顺铂化疗耐药的关系。方法:采用免疫组织化学技术检测LPA受体Edg-2、Edg-4和Edg-7蛋白质在人卵巢上皮性肿瘤组织中的表达水平。并分析LPA受体在人卵巢癌组织中的表达状况及其与顺铂化疗耐药的关系。结果:免疫组织化学检测结果显示,LPA受体Edg-2蛋白在正常卵巢组织,良性卵巢上皮性肿瘤及卵巢癌组织中表达阳性率分别为(90.0%;83.3%;45.6%),三组表达阳性率差异有显著性(χ2=11.29,P<0.01);正常卵巢组织及良性卵巢上皮性肿瘤Edg-2蛋白表达水平高于卵巢癌组织,差异有显著性P =0.001)。正常卵巢组织及良性卵巢上皮性肿瘤Edg-2蛋白表达水平相比,差异无显著性(P=0.57)。卵巢癌组织中LPA受体Edg-4蛋白表达阳性率(92.6%)与良性卵巢上皮性肿瘤(33.3%)及正常卵巢组织(30.0%)表达阳性率相比,差异有显著性(χ2=27.83,P<0.01)。良性卵巢上皮性肿瘤与正常卵巢组织Edg-4蛋白表达阳性率相比,差异无显著性(P>0.05)。卵巢癌组织中LPA受体Edg-7蛋白表达阳性率(89.7%)与良性卵巢上皮性肿瘤(41.7%)及正常卵巢组织(40.0%)表达阳性率相比,差异有显著性(χ2=22.91,P<0.01)。良性卵巢上皮性肿瘤与正常卵巢组织Edg-7蛋白表达阳性率相比,差异无显著性(P>0.05)。卵巢癌组织中Edg-2蛋白表达水平明显低于Edg-4和Edg-7蛋白表达水平,差异有显著性(χ~2=10.89,P<0.01)。Edg-2、Edg-4和Edg-7蛋白质在人卵巢上皮性癌组织中的表达水平与病理资料的相关分析显示,上皮性卵巢癌组织中Edg-4和Edg-7蛋白质的高表达与年龄及病理类型无关;与手术病理分期及病理分级有关。手术病理分期为Ⅲ~Ⅳ期的卵巢上皮性癌组织中Edg-4和Edg-7蛋白质表达明显高于Ⅰ~Ⅱ期,差异有显著性(P<0.05);病理分级为中低分化(G2~G3)癌组织中Edg-4和Edg-7蛋白质表达明显高于高分化(G1)组,差异有显著性(P<0.05)。卵巢癌组织中Edg-4与Edg-7蛋白的表达水平与顺铂敏感性的关系:Edg-4蛋白高表达组出现顺铂耐药的百分率为80%;低表达组出现顺铂耐药的百分率为24.2%;两组相比差异有显著性(P=0.001)。Edg-7蛋白高表达组出现顺铂耐药的百分率76.7%;低表达组出现顺铂耐药的百分率34.2%;两组相比差异有显著性(P =0.001)。Edg-2蛋白表达程度与顺铂耐药无明显关系。结论:在卵巢上皮性肿瘤及正常卵巢组织中存在Edg-2、Edg-4和Edg-7不同程度的表达;Edg-4和Edg-7可能与卵巢上皮性癌侵袭、进展密切相关;卵巢癌组织中Edg-4与Edg-7蛋白的高表达与顺铂耐药显著关联;LPA受体Edg-4和Edg-7可作为判断卵巢癌侵袭、进展及铂类化疗耐药的一项参考指标。第二部分:溶血磷脂酸对顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡的影响目的:探讨溶血磷脂酸对顺铂诱导的卵巢癌SKOV3和3AO细胞凋亡的影响。方法:体外培养卵巢癌细胞株SKOV3和3AO;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测LPA对卵巢癌细胞株SKOV3和3AO增殖活性的影响;用流式细胞术(FCM)分析LPA对顺铂诱导的卵巢癌SKOV3和3AO细胞凋亡的影响。细胞形态学变化及DNA ladder分析卵巢癌细胞株SKOV3和3AO的凋亡状态。结果: LPA能够对抗顺铂诱导的SKOV3和3AO细胞的凋亡,用FCM法证实顺铂对SKOV3和3AO细胞的凋亡具有浓度依赖性的诱导作用,LPA单独作用对SKOV3和3AO细胞的凋亡无明显影响,但当2.5μg/ml顺铂与10μmol/L LPA联合作用时细胞的凋亡率从顺铂单独作用的13.18士1.24%和13.02士1.18%减少至4.89士0.76%和4.99士0.85%(P<0.01),表明LPA具有对抗顺铂诱导的SKOV3和3AO细胞凋亡的作用或具有促存活的作用。顺铂诱导SKOV3和3AO细胞凋亡形态学改变表现为细胞染色质浓聚、固缩,细胞数目明显减少;琼脂糖凝胶电泳梯状DNA检测显示明显的DNA片断化现象。而LPA可明显逆转顺铂诱导的凋亡,形态学改变为细胞染色质浓聚、固缩及细胞数目减少的明显逆转,同时DNA片断化现象近消失。此外,MTT比色法测定结果显示在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中加入10μmol/L LPA,对卵巢癌SKOV3和3AO细胞增殖无明显影响。结论:顺铂诱导的卵巢癌SKOV3和3AO细胞的凋亡具有浓度依赖性。LPA具有对抗顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡的作用。LPA对抗顺铂诱导的凋亡不是借助LPA刺激卵巢癌细胞的增殖作用,而主要是通过LPA拮抗顺铂诱导的凋亡作用。第三部分:溶血磷脂酸对抗顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡的机制目的:探讨溶血磷脂酸对抗顺铂诱导的卵巢癌SKOV3细胞凋亡的机制。方法:半定量RT—PCR方法检测Bcl-2蛋白家族成员表达,Western Blot的方法检测Caspase-9和Caspase-3的活性;流式细胞术(FCM)及Western Blot分析PI3-K/Akt信号转导通路以及百日咳毒素(PTX)敏感的Gi通道在LPA抗凋亡作用中的影响。结果:半定量RT-PCR表明顺铂下调了卵巢癌SKOV3细胞中Bcl-2 mRNA的表达,LPA能上调抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA(P<0.01),并可使促凋亡蛋白Bax mRNA的表达量减少(p<0.01);但不影响Bcl-XL和Bad的表达。Caspases的激活是肿瘤细胞凋亡的重要因素之一,顺铂作用卵巢癌SKOV3细胞后,能够激活Caspase-9和Caspase-3的活性,但LPA能够明显抑制卵巢癌SKOV3细胞Caspase-9和Caspase-3的活性。由于Bcl-2和Bax均存在于线粒体膜上,而Caspase-9和Caspase-3也是通过线粒体途径激活,因此我们认为LPA可以通过影响线粒体途径发挥抗凋亡作用的。LPA与其特异性受体结合后,能激活PI3-K/Akt信号转导通路,该通路在促进细胞存活或抗凋亡过程中具有重要作用。我们用Western Blot的方法和磷酸化Akt的抗体检测细胞中磷酸化Akt(p-Akt,是Akt的激活状态)的水平,结果表明LPA可以促进Akt激活;我们进而用PI3-K的抑制剂LY294002处理SKOV3细胞,结果证实当该细胞的PI3-K活性被抑制后,Akt的磷酸化以及LPA的抗凋亡作用均明显减弱,表明PI3-K/Akt通路在LPA的抗凋亡过程中发挥着重要作用。本实验还发现PTX不但抑制了LPA刺激的Akt信号分子的磷酸化,而且阻断了LPA对顺铂诱导凋亡的拮抗作用,结果说明LPA的G蛋白偶联受体相关的Gi通道参与了LPA的抗凋亡作用。结论:LPA可以通过影响线粒体的凋亡途径发挥抗凋亡作用。LPA能够激活PI3-K/Akt信号转导通路而发挥抗凋亡作用;百日咳毒素(PTX)敏感的Gi通道参与了LPA对PI3-K/Akt信号转导通路的激活作用及LPA的抗凋亡作用。