稳定表达鸡ST3GAL Ⅰ的BHK-21细胞株的构建及禽流感病毒的增殖

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禽流感(Avian influenza,AI)是由A型流感病毒(AIV)引起禽类的一种疾病综合症,鸡、火鸡以及鸭等禽类均可感染,引起禽类死亡、产蛋量下降、严重的呼吸道病、系统综合症或隐性感染等多种病型。流感病毒通过其表面的血凝素(HA)与宿主细胞表面唾液酸寡糖受体结合侵染宿主细胞。AIV倾向识别α-2,3连接型受体(NeuAcα-2,3-Gal),而人流感病毒倾向识别α-2,6连接型受体(NeuAcα-2,6-Gal)。本研究克隆鸡β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ (ST3Gal Ⅰ)基因并将其插入真核表达载体pcDNA3.1-EGFP中构建真核表达质粒,转染BHK-21细胞后,通过G418抗性和绿色荧光蛋白标记双重筛选,鉴定一株表达ST3Gal Ⅰ阳性的单克隆细胞株,绿色荧光丰富。经流式细胞仪检测,BHK-21-ST3Gal Ⅰ细胞株中α-2,3连接型受体丰度较亲代BHK-21细胞显著提高。连续传5代10代后仍能检测到其表达,表明ST3Gal Ⅰ基因在细胞中稳定表达。为了检测BHK-21-ST3Gal Ⅰ细胞对H9亚型流感病毒和H5N1Re-5病毒的增殖效果,将H9亚型流感病毒和H5N1Re-5病毒接种BHK-21-ST3Gal Ⅰ细胞和BHK-21细胞,同时设普通胰酶和TPCK-胰酶对照组。接毒72小时后收获细胞液,常规方法测定血凝素(HA)滴度。实验结果表明,BHK-21-ST3Gal Ⅰ细胞中AIV的HA滴度达到1:256,显著高于BHK-21细胞组,表明其更适于流感病毒的增殖,具备生产流感病毒疫苗的潜力。筛选稳定表达鸡ST3Gal Ⅰ基因的BHK-21细胞株,为进一步研究AIV受体结合特性以及大规模细胞培养生产疫苗奠定基础。
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