论文部分内容阅读
脑缺血是导致人类残疾与死亡的重要疾病之一,给患者的生活造成了极大的影响。目前临床上脑缺血治疗的方案之一是联合使用溶栓药物与神经保护药物。但如何减少经溶栓处理后的再灌注损伤已经成为一个重要问题。到目前为止,尚缺乏疗效确切且能够对抗脑缺血再灌注损伤的药物。乙酰谷酰胺注射液是临床上广泛应用的脑功能改善辅助剂,其治疗脑血管疾病的有效性得到了一系列临床试验的证实,但迄今为止对乙酰谷酰胺的脑缺血神经保护作用机制尚缺乏深入探讨,因此,本研究采用线栓法建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,在整体水平上观察乙酰谷酰胺抗脑缺血再灌注损伤的有效性,并从细胞水平、分子水平等多层面探讨乙酰谷酰胺的作用机制,为其临床应用提供更全面的理论基础,为抗脑缺血的新药研发提供新思路。谷红注射液为乙酰谷酰胺和中药红花提取物制成的复方制剂,临床试验研究证实谷红注射液可以减轻急性脑梗死患者的神经功能缺损程度,促进中枢神经系统功能恢复,具有良好的临床应用价值。但由于谷红注射液的成分较复杂,目前其作用机制尚不清楚。本研究在明确谷红注射液具有抗脑缺血再灌注损伤作用的基础上,采用基因芯片技术,对谷红注射液的作用机制进行了初步探讨。第一部分 乙酰谷酰胺抗脑缺血再灌注损伤的药效学研究1.建立大鼠MCAO模型,模型组大鼠体重显著减轻(P<0.05),神经缺损症状评分显著增加(P<0.001),双侧前肢完全去除贴纸的时间显著延长(P<0.001),经过乙酰谷酰胺的治疗14 d可显著增加大鼠的体重,减少神经缺损症状评分并且可以显著缩短双侧前肢完全去除贴纸的时间(P<0.05)。2.乙酰谷酰胺治疗14d后,进行平衡杆实验,MCAO模型组大鼠过杆时间较假手术组明显延长(P<0.01)。而经乙酰谷酰胺治疗后大鼠过杆总时间明显缩短(P<0.05),并且具有较好的剂量依赖关系。3.Y迷宫实验结果显示：乙酰谷酰胺能显著改善缺血再灌注损伤诱导的大鼠学习记忆能力的下降,提高大鼠在Y迷宫实验中的正确率(P<0.05)。在自发运动实验中,乙酰谷酰胺对缺血再灌注损伤诱导的精神异常有一定的改善作用。4.TTC染色统计结果显示缺血再灌第14 d,MCAO模型组大鼠脑梗死体积显著增加(P<0.01),经过乙酰谷酰胺治疗可以显著减少脑梗死体积(P<0.05)。第二部分 乙酰谷酰胺抗脑缺血再灌注损伤的机制研究1.TH免疫组化染色结果显示,与假手术组相比,MCAO模型大鼠黑质致密区内单位面积TH阳性细胞数目以及纹状体TH阳性神经纤维的累计光密度值(IOD)均显著降低(P<0.01),而乙酰谷酰胺各剂量组单位面积TH阳性细胞数目较模型组均显著增加,TH阳性纤维的IOD值亦显著增加(P<0.01),提示乙酰谷酰胺能明显改善脑缺血再灌注诱导的黑质区神经元的继发性损伤。2.模型组大鼠黑质致密区内单位面积Iba-1阳性细胞数目较假手术组显著升高(P<0.01),形态上由椭圆形、胞体小、突起多的静止型小胶质细胞逐渐变化为圆形、胞体大、突起少的活化型小胶质细胞：乙酰谷酰胺各剂量组单位面积Iba-1阳性细胞数目较模型组均显著降低(P<0.01),形态上亦有差异。3.中脑黑质区TUNEL染色结果表明,模型组大鼠黑质区内单位面积TUNEL阳性细胞的比率较假手术组显著升高(P<0.01)而乙酰谷酰胺治疗14 d后,中、高剂量组单位面积TUNEL阳性细胞比率较模型组均显著降低(P<0.01)。4.中脑组织蛋白水平的检测结果显示,模型组大鼠前凋亡诱导因子TARF1的表达水平较假手术组显著升高,磷酸化Akt以及Bcl-2/Bax的表达水平显著降低(P<0.05)；而乙酰谷酰胺治疗14 d后,TRAF1表达水平较模型组显著降低,磷酸化Akt以及Bcl-2/Bax的表达水平均显著升高(P<0.05)。5.皮层区CD31免疫荧光染色以及VEGF蛋白表达的结果显示,模型组大鼠皮层区微血管数目较假手术组显著增多(P<0.05),微血管走形紊乱呈迂曲的不规则形状。与模型组比较,乙酰谷酰胺三个剂量组的血管密度较模型组也显著升高(P<0.05),微血管分支数目增多。血管内皮细胞因子VEGF的表达较假手术组显著降低,给予不同剂量的乙酰谷酰胺均可以提高VEGF的蛋白表达(P<0.05)。6.SVZ区Nestin染色结果显示：模型组大鼠Nest in阳性表达较假手术组显著升高,而乙酰谷酰胺中、高剂量组的Nestin阳性表达较模型组也显著升高,并有向梗死灶纹状体区域迁移的趋势。7.1μM和10μM浓度的乙酰谷酰胺对于Na2S2O4诱导的PC12细胞损伤具有明显的保护作用,表现为与模型组相比,细胞活性显著升高(P<0.05)。10 gM的乙酰谷酰胺可以显著抑制Na2S2O4诱导的PC12细胞的凋亡。8.研究发现Na2S2O4可造成PC12细胞和中脑原代神经元的线粒体膜电位显著下降,而乙酰谷酰胺可以明显改善Na2S2O4对PC12细胞和中脑原代神经元的线粒体膜电位的变化(P<0.05)。9.体外实验中,随着低氧时间的延长,Na2S2O4损伤的PC12细胞前凋亡诱导因子TRAF1的表达水平逐渐升高；10μM浓度乙酰谷酰胺治疗后,TRAF1的表达较模型组减少(P<0.05)同时能够促进凋亡通路中的上游蛋白激酶Akt磷酸化(P<0.01),提高Bcl-2/Bax的比值(P<0.05),最终抑制低氧诱导的细胞凋亡。10. TRAF1/DAPI双染的免疫荧光结果显示,在Na2S2O4损伤PCI2细胞中,TRAF1绿色荧光表达水平升高,主要在胞浆中表达；而与模型组比较,10 gM浓度的乙酰谷酰胺治疗后,发现TRAF1的绿色荧光表达下降,这与WB的结果相符。11.Na2S2O4损伤的PC12细胞中总谷胱甘肽(GSH)含量降低(P<0.01),而10μM浓度的乙酰谷酰胺可以显著提高PC12细胞中GSH的表达(P<0.05)。第三部分基于基因芯片检测技术对谷红注射液抗脑缺血作用机制初探1.谷红注射液可以显著改善MCAO模型大鼠的运动功能障碍；TH免疫组化结果显示,谷红注射液对黑质致密区TH阳性细胞有保护作用。2.与假手术组相比,MCAO模型组大鼠的纹状体的全基因表达谱芯片共筛选出显著差异表达基因共1303个,其中上调的基因985个,下调的基因318个。经过14d给药治疗,与模型组比较,谷红注射液组有812个基因发生显著改变,其中上调的基因234个,下调的基因578个。3.通过生物信息学方法进行的GO分析提示这些基因涉及受体活性、转运体、细胞发育、细胞蛋白代谢过程、系统发育、解剖结构发育、细胞分子代谢过程、受体活性、细胞受体、跨膜受体、细胞骨架蛋白等多个方面。4.我们挑选了在芯片结果中表达差异显著的7个基因进行了实时荧光定量PCR的验证,结果与基因芯片的表达趋势基本是相符的。5.通过对差异表达基因的功能分析和查阅相关文献,我们选出了与脑缺血再灌注损伤分子机制相关的26个基因作为候选验证基因。