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第一部分 Tfh细胞和OX40/OX40L分子在Graves’病患者外周血中的表达及意义[目的]研究Graves’病患者外周血中Tfh细胞的比例、OX40在各种不同T细胞(包括效应T细胞、Treg细胞和Tfh细胞)上的表达及其配体OX40L在抗原提呈细胞上的表达情况。[方法]通过流式细胞术检测健康志愿者、甲状腺腺瘤患者、Graves’病患者外周血中CD4+CD55-CD127+CXCR5+PD1+Tfh细胞比例,同时分析Tfh细胞上OX40的表达情况以及CD14+单核细胞和CD19+B细胞上OX40L的表达情况。另外,还通过流式细胞术分析效应T细胞和Treg细胞上OX40分子的表达。[结果](1)Graves’病患者外周血中Tfh比例显著高于健康志愿者和甲状腺腺瘤患者,差异具有明显统计学意义(p<0.01)。(2)Graves’病患者外周CD4+T细胞内的IL-21表达水平显著高于健康志愿者和甲状腺腺瘤患者(p<0.001);Tfh细胞中IL-21表达趋势与此一致,且均具有统计学意义(p<0.01)。(3)Graves’病患者外周Tfh细胞表面OX40分子表达水平显著高于健康志愿者和甲状腺腺瘤患者,差异具有统计学意义(p<0.05),且ICOS+Tfh细胞上OX40表达水平显著高于ICOS-Tfh细胞,差异具有统计学意义(p<0.05)。(4)Graves’病患者外周效应CD4+T细胞中OX40表达水平显著高于甲状腺腺瘤患者(p<0.05),且Treg细胞中OX40表达趋势与此一致(p<0.05)。(5)Graves’病患者外周APCs上OX40L表达水平显著高于健康志愿者和甲状腺腺瘤患者,差异具有统计学意义(p<0.05)。[结论](1)Graves’病患者外周Tfh细胞比例上调,且IL-21分泌增多,提示异常增加的Tfh细胞可能参与了 Graves’病的发生发展。(2)Graves’病患者外周OX40+Tfh细胞比例上调,且OX40主要表达在活化的Tfh细胞上,提示该疾病中OX40分子可能与Tfh细胞的异常活化密切相关。(3)Graves’病患者外周效应CD4+T细胞和Treg细胞上OX40分子表达上调,Treg细胞上OX40的表达促进Treg细胞向效应T细胞分化,从而放大效应T细胞的功能,这可能加速了Graves’病的发生。(4)Graves’病患者外周APCs上OX40L表达水平显著上调,可见APCs表面表达的OX40L可能与效应CD4+T细胞、Tfh细胞和Treg细胞上表达的OX40相互作用,从而传递OX40信号促进Treg细胞向效应T细胞分化,影响效应T细胞和Tfh细胞的分化和功能,并进而促进Graves’病的免疫病理进程。第二部分OX40+Tfh细胞生物学特性的研究[目的]研究OX40分子在感染扁桃体Tfh细胞中的表达特点,比较OX40-Tfh细胞和OX40+Tfh细胞中相关蛋白和基因的表达情况,以明确OX40+Tfh细胞的生物学特性。[方法]本部分首先通过流式细胞术检测OX40分子在不同分化阶段Tfh细胞中的表达差异,进而采用磁珠分选和流式分选获得OX40-Tfh细胞和OX40+Tfh细胞,通过基因转录组测序研究OX40-Tfh细胞和OX40+Tfh细胞的基因表达差异,并进一步通过流式细胞术比较OX40-Tfh细胞和OX40+Tfh细胞中相关分子和转录因子在蛋白表达水平上的差异。[结果](1)CXCR5high Tfh细胞中OX40分子表达显著高于CXCR5low Tfh细胞和CXCR5-非Tfh细胞,差异具有统计学意义(p<0.001)。(2)与OX40-Tfh细胞相比,OX40+Tfh细胞中多种Tfh细胞相关分子及促进Tfh细胞分化的转录因子包括 CXCR5、CXCL13、PDCD1、IL-21、BATF、CD200、BTLA、TNFRSF18、ASCL2、IRF4、STAT1、TRAF4等基因转录水平上调,而抑制Tfh细胞分化、功能以及向GC迁移的基因转录水平则下调,包括CCR7、ID2、KLF2、PIK3IP1、GPR183;此外,OX40+Tfh细胞中多种细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)、参与DNA复制所必需的蛋白以及与细胞增殖相关的基因,包括CDK4、CDK6、MCM家族基因、CDC45、E2F家族基因等也上调表达,而多种抑制细胞周期的基因以及促进细胞凋亡的基因,包括CDC14A、CDKN1B、GADD45A、SMAD3、BCL2L11、ATM等则下调表达。(3)与OX40-Tfh细胞相比,在蛋白水平上OX40+Tfh细胞中高表达Bc16、IL-21、CXCR4、Ki67,差异具有统计学意义(p<0.05)。(4)OX40L在感染扁桃体组织B细胞和CD11c+HLADR+髓系APCs上表达水平较高。[结论](1)OX40分子主要表达于成熟的GC Tfh细胞上,而在Tfh前体细胞和非Tfh细胞上表达较低。(2)OX40+Tfh细胞中多种Tfh细胞相关分子及促进Tfh细胞分化的转录因子的基因转录水平上调,而抑制Tfh细胞分化、功能以及向GC迁移的基因转录水平下调,提示OX40信号能够有助于Tfh细胞的分化和GC定位;OX40+Tfh细胞中还有多种促进细胞周期与细胞增殖的相关基因转录水平上调,而多种抑制细胞周期的基因以及促进细胞凋亡的基因转录水平则下调,提示OX40信号可能有助于促进细胞增殖并抑制细胞凋亡。(3)蛋白水平上,OX40+Tfh细胞中表达更高水平的Bc16、IL-21、CXCR4、Ki67,进一步证明该细胞是一群增殖和迁移能力较强的分化成熟的Tfh细胞。(4)OX40L在感染扁桃体APCs中高表达,提示OX40L可以与Tfh细胞上的OX40结合从而通过OX40信号影响Tfh细胞。第三部分OX40/OX40L信号对Tfh细胞分化及功能的影响[目的]研究OX40信号对不同分化阶段Tfh细胞的影响,探讨OX40信号促进Tfh细胞辅助B细胞分化和分泌抗体的作用以及信号传递途径。[方法]本部分首先通过sOX40L蛋白激发CD4+T细胞,经qPCR实验检测Tfh细胞相关分子表达情况,进而通过流式分选CXCR5high和CXCR5low两群Tfh细胞,同样通过sOX40L激发,研究OX40/OX40L信号对Tfh细胞分化和凋亡的影响;通过B细胞分别与OX40-Tfh和OX40+Tfh细胞在不同条件下进行共育,研究OX40/OX40L信号对Tfh细胞功能的影响;最后用流式细胞术研究OX40/OX40L调控Tfh细胞所涉及的信号通路。[结果](1)与对照组相比,加入sOX40L蛋白后CD4+T细胞中Bcl6、CXCR5、PD-1和IL-21 mRNA表达水平明显上调,Blimp-1 mRNA表达水平下调(p<0.05)。(2)加入sOX40L蛋白后,CXCR5high和CXCR5low这两群Tfh细胞中CD4+CXCR5highPD-1high的GC Tfh细胞比例都要显著高于对照组(p<0.05),而无论是CXCR5high组还是CXCR5low CD4+CXCR5lowPD-1low的Tfh前体细胞比例都与对照组无明显差异。(3)加入sOX40L蛋白后,与对照组相比,CXCR5high Tfh细胞中凋亡细胞比例明显下调(p<0.01),而在CXCR5low Tfh细胞中无明显差异。(4)OX40-Tfh细胞与B细胞共育时,加入sOX40L蛋白后,CD19+CD27+CD38+浆细胞比例升高(p<0.001);OX40+Tfh细胞与B细胞共育时,加入sOX40L蛋白后浆细胞比例同样升高(p<0.01),且高于OX40-Tfh细胞与B细胞共育组(p<0.0001),ELISA检测培养基上清中IgG,结果与此一致。加入阻断型Anti-OX40L单抗,浆细胞比例明显下调(p<0.01)。(5)加入sOX40L蛋白后,Tfh细胞中pPI3K和pAkt比例上调,差异具有统计学意义(p<0.05)。[结论](1)OX40/OX40L信号能够上调Bcl6、CXCR5、PD-1和IL-21的mRNA表达水平,下调Blimp mRNA表达水平,提示OX40/OX40L信号可以促进CD4+T细胞向Tfh细胞分化。(2)OX40/OX40L信号可能有助于促进Tfh前体细胞向GC Tfh细胞分化,并维持GC Tfh细胞的比例,但不能维持Tfh前体细胞的比例。(3)OX40/OX40L信号主要抑制GC Tfh细胞凋亡,对Tfh前体细胞的凋亡没有明显抑制作用。(4)OX40信号激发的Tfh细胞能够显著促进B细胞向浆细胞分化并分泌IgG抗体,而OX40信号阻断实验进一步证明了 OX40L逆向信号在Tfh对B细胞辅助中的重要作用,即OX40/OX40L信号能够增强Tfh细胞辅助B细胞的功能。(5)OX40/OX40L对Tfh细胞的影响部分依赖于PI3K/Akt信号通路。