论文部分内容阅读
手性胺是指小分子化合物手性中心的取代基含有氨基的一类化合物,是多数医药、农药的重要中间体。例如,治疗糖尿病的药物西他列汀、抗生素青霉素及广谱触杀型除草剂草铵膦等都是手性胺化合物。转氨酶制备手性胺的方法有两种,分别为动力学拆分外消旋的胺及从前手性酮不对称合成手性胺。其中不对称合成制备手性胺的理论产率能够达到100%,使转氨酶在生产工业领域具有强大的应用前景。手性内酰胺是抗生素中十分重要且具有广泛生物活性的中间体。转氨酶可催化醛酯或酮酯进行生物转化,不对称合成相应的手性胺,随后通过自发的分子内环化反应获得具有光学活性的手性内酰胺中间体。由于目前催化这一反应的转氨酶种类较少,本论文对催化手性内酰胺不对称合成进行了转氨酶的基因挖掘,最终从数据库中筛选到与模板酶相似度为29.4%来源枯草杆菌的假定转氨酶yhxA（NCBI:CAB12754.2）,氨基酸序列全长450 aa,与模板转氨酶同属乙酰鸟氨酸转氨酶家族,随后对yhxA进行了可溶表达。为了实现yhxA的可溶表达,选择了利于蛋白NI-NTA亲和层析纯化的pET表达系统。但在pET-21a,pET-28a和pET-28b上未能获得yhxA的可溶蛋白。针对这一问题,参考本实验室对多聚氨基酸修饰促进蛋白可溶表达的研究,选择不同长度的组氨酸、赖氨酸和精氨酸对yhxA的N-端和C-端进行修饰,最终实现了yhxA的可溶表达。其中可溶蛋白表达量最高的是His6-yhxA;可溶蛋白表达量较高且占总蛋白的比例最高的是His6-yhxA-Lys15。对以上可溶表达的yhxA进行初步活力测定,发现His6-yhxA-Lys10的活力最高为4.31 U/mg,并发现可溶表达量较高的yhxA之间活力相差不多。随后使用可溶表达的yhxA催化手性内酰胺不对称合成,反应效果并不理想。针对yhxA催化活性不高的问题,通过酶的理性设计对yhxA的催化性能进行改造。利用同源模建和分子对接的手段对yhxA的催化活性空腔进行分析,推测底物结合口袋的大（Large）口袋中62位的色氨酸（Trp62）体积较大造成了空间位阻,因此对这一氨基酸位点进行了饱和突变。首先在yhxA可溶表达的基础上对His6-yhxA-Lys15（Trp62）进行饱和突变,获得的突变体His6-yhxA-Lys15W62T和His6-yhxA-Lys15W62V催化α-苯乙胺和丙酮酸的转氨反应,将产物苯乙酮产率分别提高至27.9%和24.1%。实验中还发现Trp62可能影响yhxA的可溶表达,因此对表达全部为包涵体的yhxA（Trp62）进行了饱和突变,获得2个可溶表达的突变体yhxAW62F和yhxAW62Y,其中yhxAW62F将苯乙酮产率提高至38.9%,是未突变His6-yhxA-Lys15的1.95倍。随后,对突变体yhxAW62F和yhxAW62Y,以可溶蛋白表达量最高且能够纯化的His6-yhxA作为参照,进行了酶学性质的研究。结果表明三者最适温度均为40℃,在10℃下稳定性最好;最适pH均为pH 7.0,且在pH 7.0的缓冲液中稳定性更好。从金属离子稳定性的测定结果分析,实验中用到的金属离子均会使三者的活力降低。最后对yhxA进行了底物适用范围的筛选,通过外消旋-α-苯乙胺和（R）-α-苯乙胺作为胺供体的反应鉴定出yhxA是选择S-构型的ω-转氨酶;催化苯乙酮为氨基受体,异丙胺或1,5-二氨基戊烷为氨基供体的反应,未能检测到苯乙酮的减少,yhxA对这两种氨基供体没有催化活性。通过转氨酶yhxA催化的反应,目前yhxA能够识别的底物包括丙酮酸和α-苯乙胺。