论文部分内容阅读
背景间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一类具有强大自我更新能力及典型多向分化潜能的成体干细胞。人脐带来源间充质干细胞(uman umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)因其含量极其丰富,具有更低的免疫原性,采集时对供体无损伤,不涉及伦理问题,并且在促进组织修复与再生等方面具有良好的治疗效果,成为了细胞移植治疗理想的种子细胞。虽然hUC-MSCs凭借其独特的生物学特性崭露头角,但仍存在一些问题亟待解决,例如：缺少特异性的细胞表面标志；移植前的保存仍未形成标准化；hUC-MSCs进入体内之后,免疫抑制与免疫调节的不可控性、潜在的致瘤性、非治疗目的分化以及异常堆积等,都一定程度的限制了hUC-MSCs在临床应用的疗效及预后。另外,MSCs“旁分泌”作用机制的提出,使得深层次研究MSCs的作用机理显得愈发重要。一种源于细胞的膜性小囊泡——Exosomes日益成为该领域的研究焦点。Exosomes是很多细胞都能分泌的一种亚细胞结构信息复合体,被认为是一种介导细胞间信息传递的重要“内分泌”机制。与细胞分泌的其他囊泡相比,Exosomes具有更清晰的生物学特性。因此,探索优化的Exosomes制备方法,探讨Exosomes与其来源的hUC-MSCs是否具有同等的治疗效果,揭示MSCs的核心机制,成为进一步探索新型“无细胞”的干细胞治疗方法的基础所在。目的1.探索优化的hUC-MSCs源Exosomes制备方法；2.比较研究hUC-MSCs与其来源Exosomes在体内治疗效果上的差异；3.揭示干细胞发挥治疗作用的核心机制,为进一步探索“无细胞”的干细胞治疗途径提供科学基础。方法1.采用组织块直接贴壁法分离培养hUC-MSCs,所获得的细胞按照国际认可的标准进行形态学、表面标志物及多向分化能力的综合鉴定；2.采用改良差速离心法制备hUC-MSCs源Exosomes,经透射电镜行形态学鉴定,Bradford法对其蛋白定量,SDS-PAGE凝胶电泳初步分析其蛋白成分,Western blot鉴定其标志蛋白CD63、CD81;3.结扎冠状动脉左前降支建立大鼠心肌梗死模型,实验分为4组(每组n=15)：①sham+NS组,仅穿线于左前降支但不结扎,注射0.9%氯化钠注射液；②MI+NA组,注射0.9%氯化钠注射液；③MI+MSCs组,hUC-MSCs消化后以0.9%氯化钠注射液重悬细胞,调整浓度为2×106个细胞/mL后注射共80μL;④MI+Exosomes组,注射蛋白总量为80-tg的Exosomes共80μL；移植治疗于造模成功2周后进行；4.分别于造模前、造模2周后、移植治疗4周后对所有大鼠行心脏超声检查,观察其心功能变化情况；5.于移植治疗4周后取大鼠心脏,采用TTC染色法进行心肌梗死面积的测定；6.于移植治疗4周后取大鼠左心室心肌组织,采用流式细胞仪对心肌细胞的凋亡情况进行检测；7.于移植治疗4周后取大鼠左心室心肌组织,采用Western blot法检测心肌内相关凋亡蛋白Bcl-2及Caspase-3的表达情况。结果1.经组织块直接贴壁法分离培养的hUC-MSCs符合MSCs鉴定标准；2.经差速离心法所制备的hUC-MSCs源Exosomes,透射电镜下观察直径30-100nnm,胞膜完整,胞内为低电子密度成分,呈圆形或椭圆形囊泡状结构；表达标志性蛋白CD63、CD81；106个UC-MSCs细胞可提取蛋白含量为11.63±0.445μg的Exosomes;3.经心外膜直接注射法,将hUC-MSCs及其Exosomes移植入大鼠心肌梗死模型,心功能超声检查结果显示：造模前各项参数组间比较差异无统计学意义(p>0.05)；造模后2周组与造模前组相比较,sham+NS组间在各项参数上差异无统计学意义(p>0.05),其余各组LVIDd和LVIDs均有明显增大,且EF和FS均明显降低,差异具有显著性(p<0.001)；移植治疗4周后与造模2周后相比较,sham+NS组间及MI+NS组间在各项参数上差异无统计学意义(p>0.05),两移植组LVIDd和LVIDs均有所减小,且EF和FS均有所升高,差异具有统计学意义(p<0.001),但除在LVIDs参数上MI+Exosomes组与MI+MSCs组间差异有统计学意义(p<0.01)外,其余各项参数两组间均无统计学意义(p>0.05)；4.TTC法检测心肌梗死面积结果显示：sham+NS组未见明显梗死区域；与MI+NS组(42.10±1.181%)相比,hUC-MSCs移植组(31.47±0.625%)及其Exosomes移植组(33.53±0.737%)均可见心肌梗死面积减少,差异显著(p<0.001),但MI+MSCs组与MI+Exosomes组间无明显统计学差异(p>0.05)：5.流式细胞仪检测心肌细胞凋亡情况：MI+MSCs组(21.69±2.768%)与MI+Exosomes组(20.86±2.729%)较MI+NS组(36.39±1.038%)凋亡率有所下降,且差异显著(p<0.001),但MI+MSCs组与MI+Exosomes组间无明显统计学差异(p>0.05)；6.Western blot检测相关凋亡蛋白的表达,结果显示：MI+NS组较sham+NS组心肌组织中Bcl-2与Caspase-3蛋白表达均明显增高,差异具有统计学意义(p<0.001)。而hUC-MSCs与其Exosomes移植后Bcl-2蛋白表达增高,Caspase-3蛋白表达降低,与MI+NS组相比差异显著(p<0.001)；但MI+MSCs组与MI+Exosomes组间差异无统计学意义(p>0.05)。结论1.经差速离心法所制备的hUC-MSCs源Exosomes纯度较好,可为后续的体内实验提供稳定可靠的移植来源；2.hUC-MSCs及其Exosomes均可显著提高心肌梗死大鼠左心室心功能,减少心肌梗死面积,抑制心梗发生后心肌细胞的凋亡；且两者的抗凋亡作用是延缓心肌梗死病程发展的重要机制之一；3.hUC-MSCs及其Exosomes在对心肌梗死的治疗不存在差异。