哺乳动物钠离子通道在生理和病理过程中发挥着重要功能,但它们的结构与功能关系研究进展缓慢。大量作用于钠离子通道的蝎毒素多肽在钠离子通道结构与功能研究中发挥了极其重要的作用。由于这类蝎毒素通常含有60-70个氨基酸残基且有4对二硫键,它们的分离制备仍面临着巨大的挑战。由于蝎毒液量微且成分复杂,传统的生化分离技术难以获得毫克级单一蝎毒素多肽。运用基因工程技术,截止目前仅成功制备了少量蝎毒素,更多重组蝎毒素的制备仍具有极大的不确定性。因此,迫切需要深入探索低经济成本且易推广应用的蝎毒素基因工程制备技术,对于加速认识蝎毒素的结构与功能关系、推进蝎毒素生物医药应用具有重要理论意义和应用前景。首先,本论文开展了系列蝎毒素的表达纯化及功能鉴定研究。以来源于我国马氏正钳蝎和细尖狼蝎中不同蝎毒素为研究对象,分别采用pET-14b和pET-28a表达载体,通过变性和体外重折叠策略分别制备重组蝎毒素BmaTX47, BmaTX14, BmKIM. Lm3272和Lm4404。试验发现运用两种表达载体中均可制备重组蝎毒素BmaTX47和BmaTX14;仅pET-14b载体可用于制备蝎毒素BmKIM,但得率很低；两种载体均不能用于制备蝎毒素Lm3272和Lm4404。药理学试验进一步表明了运用不同表达载体获得蝎毒素的活性也具有不同的差别。如10μM蝎毒素BmaTX47(pET-28a)能够延缓rNav1.2和hNav1.5通道电流的快速失活,其I5ms/lpeak值分别为44.12±3.17%和65.34±3.86%；而同样浓度蝎毒素BmaTX47(pET-14b)对rNav1.2和hNav1.5通道的l5ms/lpeak值分别为11.33±1.46%和5.24±2.38%。蝎毒素BmaTX14的药理学活性受表达载体的影响较小。两种载体来源的BmaTX14能够选择性作用于mNav1.4,其EC5o分别为32.68±6.51nM和82.3±15.7nM。运用表达载体pET-14b获得的蝎毒素BmKIM在1μM浓度下对rNav1.2具有一定的延缓失活效果,但不作用于mNav1.4和hNav1.5.这些结果显示了可能需要表达更多的蝎毒素,进而挖掘影响蝎毒素制备的潜在因素,从而提高蝎毒素的制备水平,为蝎毒素的基础与应用基础研究提供技术保障。其次,本论文以蝎毒素BmaTXH14为分子工具,探测了影响蝎毒素识别的钠离子通道mNav1.4的重要功能残基。基于氨基酸残基定点突变技术,对：nNav1.4通道第四个结构域(DIV)的跨膜螺旋S1-S2和S3-S4的胞外loop区域分别进行了点突变扫描。药理学试验发现,在DIV/S1-S2的loop结构中mNav1.4通道E1367A. V13676A. D1377S和N1381W突变体分别使BmaTX14的活性降低了71.12、67.53、72.47和68.31倍。在DIV/S3-S4的loop结构中mNav1.4通道G1424F, D1429A, D1429E, Q1432D和K1433D等突变体分别导致蝎毒素BmaTX14的ECso下降了85.3、1259.5、421.8、40.9和480.2倍。这些结果表明了钠离子通道mNav1.4的DIV/S1-S2和S3-S4胞外环决定了蝎毒素BmaTX14的药理学活性。为了进一步阐明蝎毒素BmaTXM与通道mNav1.4相互作用机制,以对毒素BmaTXH不敏感的钠通道rNav1.2(EC50为54193±1300μM)为基础,将通道rNav1.2和mNav1.4第四个结构域的胞外环进行替换。药理学试验证实了DIV/S3-S4结构域对于蝎毒素BmaTX14活性发挥关键作用,而DIV/S1-S2结构域对于蝎毒素BmaTXH活性也具有一定影响。在此基础上,运用计算机模拟技术,分析了蝎毒素BmaTXM和通道mNav1.4相互作用的分子机制。结果提示了蝎毒素BmaTX14结合到钠通道Nav1.4第四个结构域的胞外侧,其8-18位氨基酸残基以楔形插入到Nav1.4DIV/S1-S2和S3-S4构成的结合位点中,该区域的氨基酸残基与BmaTX14的功能区域形成数对盐桥及疏水簇,从而稳定了毒素-钠通道复合物。这些研究结果阐明了作为a-like类型蝎毒素BmaTXH与钠离子通道相互作用的机制。最后,本论文在蝎毒素层面上探讨了蝎毒素选择性作用钠离子通道的机制。以选择性作用于通道Nav1.4的a-like毒素BmaTXH和同时作用于通道Nav1.2及Nav1.4的经典α-毒素Lqh2为对象,针对7-10位、15-21位、39-41位及54-64位氨基酸残基形成的差异较大区域,将蝎毒素BmaTXH和Lqh2的这些差异区域进行互换。药理学试验发现15-21位氨基酸残基的替换会导致蝎毒素BmaTXH对通道Nav1.2和Nav1.4的选择性发生逆转,即特异性作用于Nav1.2而非Nav1.4；而蝎毒素Lqh2中15-21位氨基酸残基的替换也会导致其对Nav1.4的活性高于对Nav1.2的活性,呈现与野生型Lqh2相反的现象。这些结果表明了毒素Core-domain中15-21位氨基酸残基对毒素的通道亚型选择性的关键作用。此外,蝎毒素的其它差异区域也在一定程度上影响毒素的选择性作用。这些发现为设计及改造蝎毒素及其医药应用提供了富有价值的参考。综上述,本论文开展了系列蝎毒素的表达纯化及功能鉴定研究,发现了表达载体pET-14b和pET-28a在不同程度上影响了蝎毒素多肽的药理学活性。基于所发现高药理学活性蝎毒素BmaTXH,深入开展了影响蝎毒素活性的钠通道Nav1.4的功能残基及其分布特征。同时,探讨了影响毒素选择性的关键结构区域。这些研究结果为建立稳定的蝎毒素基因工程制备技术,深入开展不同蝎毒素的结构与功能关系、促进蝎毒素的生物医药应用奠定了重要的基础。