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香蕉枯萎病是困扰热带香蕉行业多年的难题。香蕉枯萎病的致病菌是真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,FOC),其能侵染香蕉根部从而引起的维管束病害,导致维管束木质化。由于尖孢镰刀菌是通过土壤传播,难以防治,对香蕉产业造成了毁灭性危害。香蕉枯萎病一直是热带作物病害的研究热点,目前已有越来越多的高新技术被应用于香蕉枯萎病防治。人工肽适体(peptide aptamer或pepaptamers)是一种筛选自人工合成的随机氨基酸文库,可高特异性、高亲和力结合靶标蛋白质的短肽,可用于研发具有潜在应用价值的生物抗菌剂。将人工肽适体应用于香蕉枯萎病防治,是香蕉产业病害防控研究的新突破。本研究基于高容量肽适体文库,在作用靶标未知的情况下对尖孢镰刀菌孢子进行抑菌实验,筛选出能够特异性抑制尖孢镰刀菌,且对香蕉植株无害、环境友好型的肽适体,并研究其作用机制。主要研究结果如下:(1)通过抑菌实验初步筛选出对尖孢镰刀菌有抑制作用的肽适体SNP-D4,测序结果显示其全长576 bp,编码191个氨基酸,整体蛋白分子量大小为21 kDa。(2)构建SNP-D4与支架蛋白SN的原核表达载体,通过探索诱导条件,成功诱导SNP-D4和SN蛋白表达,并且获得纯化后可溶的SNP-D4和SN蛋白。(3)使用表达人工肽适体SNP-D4的细菌全蛋白提取液进行抑菌实验,发现其能将尖孢镰刀菌孢子的萌发率降低至19.60%,与PBS对照组的萌发率差异达到极显著水平。而人工肽适体的支架蛋白SN并未对孢子萌发率有显著影响(处理后萌发率为72.10%),说明发挥抑菌功能的为人工肽适体SNP-D4可变肽段部分的16个氨基酸。(4)使用纯化后的SNP-D4进行梯度抑菌实验,发现SNP-D4蛋白对尖孢镰刀菌孢子的萌发率的抑制随浓度增加而增强,呈浓度依赖型。使用4μM以上的SNP-D4就可以将萌发率降低到极显著水平。(5)通过平板实验探究SNP-D4能否永久性杀灭尖孢镰刀菌,结果发现,经8 μM SNP-D4处理的孢子在PDA培养基上长出的菌落数极显著低于经PBS或SN处理的对照组,表明SNP-D4对尖孢镰刀菌孢子具有杀菌作用。(6)使用PI荧光染色实验研究SNP-D4能否破坏病原孢子外膜,结果发现,经过SNP-D4处理后,病原孢子能够被PI染色,在激发光下发出红色荧光,而经PBS或SN处理的阴性对照组不能被PI染色,说明SNP-D4能够破坏孢子外膜。(7)利用SNP-孢子全蛋白Pull-down实验结合质谱分析捕获并鉴定肽适体SNP-D4与病原孢子的互作蛋白,共得到8个候选互作蛋白,其蛋白编号分别为W9HRQ49、N1RI26、F9G3P4、W9PJB7、A0A0D2YBZ1、A0A0D2Y610、F9F542、X0ADE9。(8)通过卷积神经网络预测SNP-D4与病原孢子的互作蛋白,并与质谱鉴定结果比较,发现3个候选互作蛋白被重复鉴定,其中包含W9PJB7——乙醛脱氢酶蛋白,为生物代谢途径的关键酶,许多抗生素均通过抑制乙醛脱氢酶达到杀菌目的。(9)建立SNP-D4与W9PJB7的分子对接模型,推测SNP-D4可能通过肽环上的Thr66与W9PJB7酶催化活性中心附近的Tyr437结合,从而抑制乙醛脱氢酶活性,导致生物体乙醇代谢受损,达到抑菌效果。