传统的微生物发酵利用玉米、马铃薯淀粉等物质进行发酵生产。随着近些年的人口增涨趋势,粮食需求量也在增加,而生产条件的约束导致粮食进一步增产的难度加大,粮食来源的淀粉糖紧缺。木质纤维素是自然界中储量最大的可再生资源物质,其酶解或水解物含量较多的葡萄糖和木糖有作为发酵底物的潜质。从长远发展考虑,开发利用木质纤维素不仅促进低原料成本生产,还可以优化和减轻资源负担。丙酮酸是细胞代谢的关键中间产物,为多种氨基酸、油脂、生物碱类、萜类的合成前体,现已广泛应用于食品、医药、化工等领域,市场缺口大。现阶段国内外丙酮酸的生产菌株主要为酵母,由于酵母菌较窄的底物谱,且酵母菌的耐糖和副产物的耐受性差,在大规模生产中有一定缺陷。因此构建一株可利用木质纤维素来源的葡萄糖和木糖产丙酮酸且环境耐受性强的优良生产菌株,具有十分重要的意义。本论文利用代谢工程策略,以野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032为研究对象。通过重构木糖代谢途径,截断旁支路副产物合成途径,调控辅因子平衡,实现了利用葡萄糖和木糖高效生产丙酮酸,主要结论如下:(1)通过重构木糖代谢途径,实现C.glutamicum ATCC13032利用木糖合成丙酮酸。将来源于野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的木糖异构酶基因xly A单个或组合木酮糖激酶基因xly B,转酮醇酶基因tkt A和转醛酶基因tal克隆到E.coli-C.glutamicum穿梭表达载体p JYW-4中,转化C.glutamicum ATCC13032并进行摇瓶发酵。发现单个表达xly A基因,ATCC13032可代谢木糖合成丙酮酸。当xly A和xly B,或xly B-tkt A-tal共表达时均可显著提高丙酮酸的产量。发酵培养72 h后,YLY/p JYW-4-xly A-xly B-tkt A-tal的丙酮酸产量提高至2.73 g/L,比亲本菌提高了77.12%,其木糖得率为0.195 g/g。(2)通过截断旁支路副产物合成途径,促进重组菌YLY/p JYW-4-xly A-xly B-tkt A-tal高效合成丙酮酸。基于同源重组-位点特异重组的Cre/lox P基因敲除系统对丙氨酸转氨酶基因ala T和丙酮酸氧化酶基因pqo分别进行了单独敲除和双敲,构建了突变菌株YLY-1/p JYW-4-xly A-xly B-tkt A-tal、YLY-2/p JYW-4-xly A-xly B-tkt A-tal和YLY-3/p JYW-4-xly A-xly B-tkt A-tal。发酵培养72 h后,单独敲除ala T或pqo,丙酮酸产量分别提高了81.20%和102.21%,L-丙氨酸或乙酸产量分别下降了29.21%和18.03%。当ala T和pqo共同敲除,丙酮酸产量提高了263.40%,达到15.59 g/L,L-丙氨酸和乙酸下降了30.11%和20.56%。(3)通过过量表达NADH氧化酶,调控NAD~+/NADH的氧化还原平衡,控制碳代谢流,进一步提高C.glutamicum ATCC13032的丙酮酸生产效率。将来源于短乳杆菌Lactobacillus brevis CD0817、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168和肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae R6的NADH氧化酶基因nox E在YLY-3/p JYW-4-xly A-xly B-tkt A-tal进行组成型表达。研究发现,YLY-3/p JYW-4-xly A-xly B-tkt A-tal-nox E3中NADH氧化酶过量表达,NAD~+/NADH比例提高较ATCC13032和YLY-3/p JYW-4-xly A-xly B-tkt A-tal分别提高了278.28%和68.25%,丙酮酸产量为22.02 g/L,提高了424.29%和41.24%。而YLY-3/p JYW-4-xly A-xly B-tkt A-tal-nox E1和YLY-3/p JYW-4-xly A-xly B-tkt A-tal-nox E2不能表达nox E1和nox E2编码的NADH氧化酶,与对照YLY-3/p JYW-4-xly A-xly B-tkt A-tal相比无酶活和丙酮酸生产水平的提高。