异源多倍体在进化过程中经历了杂交与加倍,新基因组形成后会出现遗传和表观遗传的变异现象,例如基因重排、基因组结构变异、转座子激活、基因表达水平和表达模式的变化及DNA甲基化变异等。因此,探究异源多倍体在形成早期发生变异的可能机制,对丰富多倍体进化理论有重要的意义。异源四倍体甘蓝型油菜(Brassica napus L.)由二倍体祖先种白菜(Brassica rapa L.)和甘蓝(B.oleracea L.)通过种间杂交后染色体加倍得到,因其具有清晰系谱信息而成为研究植物异源多倍体化的重要对象之一。本实验以课题组前期人工合成的甘蓝型油菜及其二倍体亲本(白菜与甘蓝)为材料,分析了人工合成甘蓝型油菜形成早期在形态学和细胞学等方面与亲本之间的差异;同时,利用RNA-seq数据对异源多倍化的甘蓝型油菜基因组中基因与转座子的表达变异特征进行分析,从分子水平上探究甘蓝型油菜基因组形成早期的基因组变异;另外,还利用分子标记技术探究了人工合成甘蓝型油菜多倍化过程中DNA甲基化与转座子的多态性变异情况及可能的形成机制。主要结果如下:1、人工合成甘蓝型油菜与二倍体亲本表型比较分析比较人工合成甘蓝型油菜及其二倍体亲本白菜和甘蓝的形态学(如株型、叶片和花器官)和种子细胞学,发现人工合成甘蓝型油菜在表型上发生一系列变化,主要包括:①植株株型较大且为松散型,有效分枝数较多,分枝部位较低,一次有效分枝的结角数较多,每角粒数变多等。②叶表皮不光滑、叶脉有少量表皮毛,叶缘呈锯齿状且有表皮毛,有叶耳。③花瓣形态与甘蓝相似,花瓣颜色接近白菜,但花粉活力明显比亲本的强(分别为97.1%、92.1%和75.09%)。④在单位面积内叶表面气孔数目增多、密度较大,但气孔的长度和宽度比白菜小。⑤利用光学显微镜与电子显微镜观察和比较成熟种子内部显微结构差异。结果显示:白菜、甘蓝的种皮纹饰和网脊形态差异明显,杂种后代种皮纹饰接近白菜、呈网纹状,脊条粗短有微穴并与甘蓝相似。白菜的栅栏层细胞呈深褐色,甘蓝的栅栏层细胞呈淡黄色,而杂种后代的栅栏层颜色介于两个亲本之间。杂种后代的糊粉层细胞最厚,甘蓝的最薄。三者胚根中央分生细胞的蛋白体面积显著低于胚根周围薄壁细胞,而油体相对面积则相反;其中杂种后代中央分生细胞中的蛋白体面积最高,周围薄壁细胞中蛋白体面积居于二者之间。杂种后代子叶中蛋白体积累最少,油体的体积最大且以长形为主,而两亲本子叶中蛋白体积累相对较多,油体较小呈圆形或椭圆形。2、人工合成甘蓝型油菜和二倍体亲本的转录组比较研究利用RNA-seq技术对人工合成的甘蓝型油菜及其亲本的叶片转录组进行比较分析,结果包括:①在白菜型油菜、甘蓝及人工合成甘蓝型油菜中检测到表达的基因分别为21,491、21,947和40,544。甘蓝型油菜与白菜相比有183个基因上调、2,192个基因下调;与甘蓝比较有548个基因上调、1,894个基因下调。这些后代与亲本之间的差异表达基因主要与物质合成、信号转导、响应胁迫等生物学过程有关。②对杂种后代中17,823对部分同源基因的表达特征进行分析,发现多数部分同源基因(占63.77%)的表达模式与两个亲本的表达模式一致,可认为多倍化过程中部分同源基因对的表达模式比较保守;通过部分同源基因对的表达偏好性分析发现12,221个基因的表达水平没有差异,即它们不存在表达偏好性,另有2,322个部分同源基因对偏向A基因组表达,3,280个部分同源基因对偏向C基因组表达。③对差异表达的部分同源基因对进行分析发现,713个基因以加性表达形式出现;分别有 2,628 个和 3,162 个基因以 C-ELD(C-Expression Level dominance)和 A-ELD(A-Expression Level dominance)形式出现;而超亲下调或上调表达的基因有54个和1,056个。基因功能注释分析显示C-ELD和A-ELD类型的基因与水杨酸合成、防御生物胁迫、MAPK途径、RNA甲基化、核苷酸生物合成、rRNA加工及蛋白质运输等相关;超亲上调表达的基因涉及色素、类黄酮及有机物等物质的生物合成过程。3、人工合成甘蓝型油菜和二倍体亲本转录组中转座子的分析深入挖掘RNA-Seq数据,利用比较基因组学的手段从全基因组层面分析了人工合成甘蓝型油菜与二倍体亲本(甘蓝和白菜)之间转座子含量、种类和数量分布、表达模式及表达水平等方面的差异,结果表明:①两个亲本转录组中转座子所占比例分别为32.56%和14.76%,人工合成甘蓝型油菜转录组中转座子占的比例为18.09%。在三个物种转录组中鉴定到了 12 种类型的转座子(hAT、C4CTA、PIF-Harbinger、Mutator、Pong、Tcl/Mariner、Helitron、LTR/Copia、LTR/Gypsy、LTR/Unclassified、SINE 和 LINE),其中占比例最多的是 CACTA(2.02%～5.44%)、Pong(2.66～6.71%)、LTR/Copia(4.32%～10.90%)和LTR/Gypsy(2.20%～4.75%),其他类型转座子在转录组中所占比例较小(约为0.09%～0.94%)。②根据RPKM值判断转座子表达水平的差异,分析发现人工合成甘蓝型油菜与白菜相比有154个表达上调和162个表达下调的转座子;与甘蓝相比有147个表达上调和190个表达下调的转座子;数目最多的差异表达转座子是C4CT4、Pong、LTR/Copia、LTR/Gypsy和LTR/Unclassifed。③人工合成甘蓝型油菜中转座子的表达模式主要以新出现、沉默及只在一个亲本和杂种后代中表达的模式出现。④对转座子插入基因内部的偏好性分析发现,基因内含子区域比外显子区更容易插入转座子;对有转座子插入的基因注释分析,显示这部分基因涉及细胞组分、生物进程和分子功能三个方面。细胞组分方面主要与细胞质、细胞核、叶绿体、质膜及色素等有关;生物进程方面主要与蛋白质代谢、抵抗胁迫、信号转导、细胞组成和生物转化、其他代谢途径和细胞化进程等有关;分子功能方面与核苷酸结合、DNA(或RNA)结合、蛋白结合、转移酶活性、水解酶和其他酶活性有关。这些结果暗示着转座子对基因组结构的形成和基因功能的发挥有重要作用。4、人工合成甘蓝型油菜基因组中的反转座子及反转录酶序列分析采用反转座子插入位点间扩增多态性分子标记方法(Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism,IRAP)对人工合成甘蓝型油菜全基因组中的反转座子的变化规律和可能作用机制进行分析;同时也对反转座子的反转录酶序列构成和进化关系进行分析。结果表明:①377对反转座子引物进行随机组合,共扩增出1,729个条带,亲本条带占71.13%,杂种中消失与新增的条带分别占5.73%和7.63%,未知条带占15.50%,多倍化过程中反转座子的激活频率为0.134。②成功克隆了 70条包含有反转座子的序列,并进行功能预测分析,结果显示有反转座子插入的基因主要与分子功能、生物进程及细胞组分三方面,其中比例最多的是催化或结合、特殊大分子复合物、内膜系统、其他代谢过程等。这说明基因和反转座子之间有紧密关系,可能对多倍体适应新环境有重要意义。③利用兼并引物对反转座子的反转录酶进行扩增,成功分离和克隆了 32条反转录酶序列,核苷酸序列长度变化范围为275～284bp,氨基酸序列中包含三个保守区:TAFLHG、LYGLKQ和YVDDM,这说明反转座子反转录酶序列具有同源性和高度异质性的特点。将克隆的序列与其他物种反转录酶的氨基酸序列进行聚类分析,发现它们具有同源性,这意味着不同物种中的反转座子在物种形成前可能拥有共同的祖先。5、人工合成甘蓝型油菜早期世代DNA甲基化的变化分析DNA甲基化作为常见的表观遗传修饰,在多倍化过程中起着重要的作用。本研究以人工合成甘蓝型油菜早期世代(F1,S1-S3)及其亲本白菜型油菜和甘蓝为实验材料,通过DNA甲基化敏感扩增多态性(Methylation Sensitive Amplification Polymorphism,MSAP)技术和高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)技术对甘蓝型油菜多倍化过程中DNA甲基化水平的动态变化进行分析。结果表明:①在F1中有53.4%的片段是来源于A和C基因组。除此之外,在杂种后代中分别有5.04%和8.87%的片段是属于新增带和消失带。②与二倍体亲本相比,人工合成甘蓝型油菜F1代中有13.1%的基因位点发生了甲基化的改变,其中有7.86%的位点属于高甲基化,5.24%的位点属于DNA甲基化。利用MSAP技术比较人工合成甘蓝型油菜F1及S1-S3代中的DNA甲基化水平差异,发现F1的甲基化水平最低(38.7%),S3世代中的甲基化水平最高(41.32%)。对DNA甲基化变异片段进行序列分析,发现其广泛参与了多种生物学途径,包括一些转录调控因子、蛋白修饰及转运蛋白等。对DNA甲基转移酶基因的表达进行分析发现,在不同的材料之中甲基化酶基因的表达水平与DNA甲基化状态是一致的。