砷污染已经成为全世界广泛关注的严重环境问题之一，砷中毒造成人体多器官和多系统损害，长期砷暴露引起皮肤癌、肺癌和肝癌等多种癌症，但砷化物致癌机制目前尚不清楚。深入研究砷化物致癌机制对于砷中毒的防治具有十分重要的理论意义和应用价值。丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路对细胞增殖、分化、凋亡、坏死具有重要调控作用。哺乳动物细胞的MAPKs信号通路主要包括3条亚信号通路：细胞外信号转导激酶（ERKs）信号通路，主要功能是促进细胞增殖与分化；c-Jun N-端激酶（JNKs）信号通路和p38信号通路，其主要功能是促进细胞凋亡与死亡。微小RNA（miRNA）与多种肿瘤的发生存在着密切的关系，研究发现miRNA在正常组织和肿瘤组织中的表达水平存在显著差别，从而提示miRNA在肿瘤进程中发挥重要作用。尽管miRNA的生物学作用和机制已逐渐被了解，但是其在环境致癌物所致细胞恶性转化和致癌过程中的作用及其分子机制尚不清楚。miR-21具有调节细胞增殖、分化、凋亡与迁移的功能，其与肿瘤发生发展、侵袭转移以及预后有密切关系。根据本课题组以往研究发现低水平亚砷酸钠（NaAsO2）慢性处理所致细胞恶性转化和诱导miR-21表达升高等研究结果，结合文献报道MAPKs信号通路可通过调控其下游转录因子如AP-1、NF-κB和Ets1等促进miR-21转录表达，且miR-21靶蛋白Spry1和Pdcd4可分别负反馈调控ERK和JNK信号通路。因此，我们推测miR-21与ERK/NF-κB和JNK/c-Jun的两条反馈环路参与了低水平NaAsO2所致细胞恶性转化过程。为此，本研究在课题组前期构建的低水平NaAsO2慢性处理所致人胚胎肺成纤维（HELF）细胞恶性转化模型基础上，应用多种分子生物学方法探讨miR-21与MAPKs信号通路在低水平NaAsO2所致HELF细胞恶性转化过程中的相互作用及其分子过程，以揭示低水平砷化物所致细胞恶性转化的部分分子机制，从而为进一步理解砷化物致癌的分子机制和寻找砷中毒的生物学标志及防治措施提供一定的科学依据。方法一、低水平亚砷酸钠对HELF细胞MAPKs和PI-3Ks信号通路的影响分别用0.0或1.0μM NaAsO2处理HELF细胞30代后；或分别用1.0μMNaAsO2处理HELF细胞0、6或24h。用Western blot检测MAPKs相关信号分子ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38，转录因子NF-κB p65、p-NF-κB p65、c-Jun、p-c-Jun及PI-3Ks相关信号分子Akt、p-Akt的表达水平，以观察低水平NaAsO2对HELF细胞MAPKs和PI-3Ks信号通路的影响。二、低水平亚砷酸钠对HELF细胞miR-21及其靶蛋白水平的影响分别用0.0或1.0μM NaAsO2慢性处理HELF细胞30代后；或分别用0.0或1.0μM NaAsO2处理HELF细胞0、6或24h。用实时定量PCR（qRT-PCR）检测miR-21水平；分别用Western blot和RT-PCR检测miR-21靶基因Pdcd4和Spry1的蛋白水平和mRNA水平，以观察低水平NaAsO2对HELF细胞miR-21及其靶蛋白水平的影响。三、MAPKs和PI-3Ks信号通路在低水平亚砷酸钠所致HELF细胞miR-21水平升高及其靶蛋白水平降低中的作用分别用10.0μM Akt抑制剂LY294002、ERK抑制剂U0126或JNK抑制剂SP600125处理HELF-30T细胞后，或分别用20nM Con siRNA、NF-κB p65siRNA或c-Jun siRNA处理HELF-30T细胞后，用Western blot检测Akt、ERK、JNK、NF-κBp65和c-Jun水平及其磷酸化程度及Pdcd4、Spry1、cleaved caspase-3和caspase-3水平；用qRT-PCR检测miR-21水平；用RT-PCR检测Pdcd4和Spry1mRNA水平，以观察MAPKs和PI-3Ks信号通路在低水平NaAsO2所致恶性转化HELF细胞miR-21水平升高和其靶蛋白Pdcd4和Spry1水平降低及细胞凋亡中的作用。四、miR-21在低水平亚砷酸钠所致HELF细胞Pdcd4和Spry1蛋白水平降低中的作用分别用150nM anti-miR-nc或anti-miR-21转染HELF-30T细胞24h后，或分别用100nM miR-nc-mimic或miR-21-mimic转染正常HELF细胞24h后，用qRT-PCR检测miR-21水平；分别用Western blot和RT-PCR检测Pdcd4和Spry1的蛋白和mRNA水平，以从反向和正向观察miR-21在低水平NaAsO2所致HELF细胞靶蛋白Pdcd4和Spry1水平降低中的作用。五、miR-21通过Pdcd4和Spry1分别反馈调控JNK和ERK信号通路用150nM anti-miR-nc或anti-miR-21转染HELF-30T细胞24h后，或用pIRES-Pdcd4或pIRES-Spry1质粒分别转染HELF-30T细胞24h后，用Western blot检测JNK、c-Jun、ERK和NF-κB蛋白水平及其磷酸化程度、Pdcd4和Spry1蛋白水平，以从反向和正向观察miR-21在低水平NaAsO2所致恶性转化HELF细胞中通过Pdcd4和Spry1分别反馈调控JNK和ERK信号通路。六、miR-21对低水平亚砷酸钠所致恶性转化HELF细胞恶性程度、迁移能力及细胞凋亡的影响分别用150nM anti-miR-nc或anti-miR-21转染HELF-30T细胞24h后，用软琼脂集落实验检测细胞恶性程度；用划痕实验检测细胞迁移能力；用Westernblot检测cleaved caspase-3和caspase-3水平，以观察下调miR-21对低水平NaAsO2所致恶性转化HELF细胞的恶性程度、迁移能力及细胞凋亡的影响。结果一、低水平亚砷酸钠对HELF细胞MAPKs和PI-3Ks信号通路的影响结果发现1.0μM NaAsO2慢性处理和急性处理均引起HELF细胞p-ERK和p-JNK、p-NF-κB p65、p-c-Jun和p-Akt水平明显升高，而p-p38水平未见明显改变。说明低水平NaAsO2可激活MAPKs信号通路中的ERK和JNK，而对p38影响不大，并可激活PI-3Ks信号通路中的Akt及转录因子NF-κB和c-Jun。二、低水平亚砷酸钠对HELF细胞miR-21及其靶蛋白水平的影响结果发现1.0μM NaAsO2慢性和急性处理均引起HELF细胞miR-21水平明显升高，而其靶蛋白Pdcd4和Spry1蛋白水平明显降低，但Pdcd4和Spry1mRNA水平未见明显改变。说明低水平NaAsO2引起HELF细胞miR-21水平升高和Pdcd4及Spry1蛋白水平降低。三、MAPKs和PI-3Ks信号通路在低水平亚砷酸钠所致HELF细胞miR-21水平升高及其靶蛋白水平降低中的作用结果发现ERK抑制剂U0126和JNK抑制剂SP600125均能引起HELF-30T细胞miR-21水平明显降低，而Spry1和Pdcd4蛋白水平明显升高，并使cleavedcaspase-3水平升高而caspase-3水平降低，而Spry1和Pdcd4的mRNA水平未发生明显改变；而Akt抑制剂LY294002处理后对上述指标均无明显改变。关闭NF-κB p65和c-Jun均明显引起HELF-30T细胞miR-21水平明显降低，而Spry1和Pdcd4蛋白水平明显增加，cleaved caspase-3水平升高和caspase-3水平降低，但Spry1和Pdcd4mRNA水平未见明显变化。说明ERK/NF-κB和JNK/c-Jun信号通路而非PI-3Ks信号通路参与了低水平NaAsO2慢性处理所致恶性转化HELF细胞miR-21水平升高，Spry1和Pdcd4蛋白水平降低及细胞凋亡。四、miR-21在低水平亚砷酸钠所致HELF细胞Pdcd4和Spry1蛋白水平降低中的作用结果发现转染anti-miR-21的HELF-30T细胞miR-21水平明显降低，且Pdcd4和Spry1蛋白水平均显著高于未转染HELF-30T细胞；转染miR-21-mimic的正常HELF细胞miR-21水平也明显升高，而其Pdcd4和Spry1蛋白水平均显著降低，但是Pdcd4和Spry1mRNA水平均未发生明显改变。说明在低水平NaAsO2所致HELF细胞恶性转化过程中miR-21通过调控Pdcd4和Spry1蛋白水平发挥作用。五、miR-21通过Pdcd4和Spry1分别反馈调控JNK和ERK信号通路结果发现通过anti-miR-21下调miR-21水平后，HELF-30T细胞Pdcd4和Spry1蛋白水平升高，而p-JNK和p-ERK水平降低；转染pIRES-Pdcd4重组质粒上调Pdcd4水平后，HELF-30T细胞p-JNK和p-c-Jun水平明显降低；转染pIRES-Spry1重组质粒上调Spry1水平后，HELF-30T细胞p-ERK和p-NF-κB p65水平明显降低。说明miR-21在低水平NaAsO2所致恶性转化HELF细胞中通过靶蛋白Pdcd4和Spry1分别反馈调控JNK/c-Jun和ERK/NF-κB信号通路。六、miR-21对低水平亚砷酸钠所致恶性转化HELF细胞恶性程度、迁移能力及细胞凋亡的影响结果发现通过转染anti-miR-21下调miR-21的HELF-30T细胞在软琼脂上形成的集落数明显低于对照HELF-30T细胞，且集落大小也明显变小，其划痕愈合率也明显低于对照HELF-30T细胞，而cleaved caspase-3水平升高和caspase-3水平降低。说明下调miR-21可明显降低低水平NaAsO2所致恶性转化HELF细胞的恶性程度、迁移能力和促进细胞凋亡。结论1、低水平NaAsO2可激活HELF细胞MAPKs信号通路中的ERK和JNK，而对p38影响不大，并可激活PI-3Ks信号通路中的Akt及转录因子NF-κB和c-Jun。2、低水平NaAsO2所致恶性转化HELF细胞中miR-21水平升高而Pdcd4和Spry1蛋白水平降低。3、ERK/NF-κB和JNK/c-Jun信号通路而非PI-3Ks信号通路参与了低水平NaAsO2慢性处理所致HELF细胞miR-21水平升高和Spry1和Pdcd4蛋白水平降低及细胞凋亡。4、miR-21在低水平NaAsO2所致恶性转化HELF细胞中可通过靶蛋白Pdcd4和Spry1分别反馈调控JNK和ERK信号通路。5、miR-21促进低水平NaAsO2所致恶性转化HELF细胞的恶性程度和迁移能力及抑制细胞凋亡。总之，本研究结果提示低水平NaAsO2激活ERK/NF-κB和JNK/c-Jun信号通路，引起miR-21水平升高而抑制靶蛋白Spry1和Pdcd4表达水平，从而引起HELF细胞异常增殖和细胞凋亡减少，最终导致细胞恶性转化，而且miR-21又可通过Spry1和Pdcd4分别反馈调控ERK/NF-κB和JNK/c-Jun信号通路。本研究结果说明miR-21与MAPKs信号通路反馈调控在NaAsO2所致HELF细胞恶性转化中发挥重要作用。