研究背景与目的临床上,Oddi括约肌(sphincter of Oddi,SO)松弛在肝胆管结石患者比较常见,由于SO松弛可能诱发返流性胆管炎,从而使肝胆管结石复发增加,因此,SO松弛与否是术中是否废弃SO行胆肠吻合的主要参考因素。但随着胆肠吻合术后吻合口狭窄、癌变以及结石复发等远期并发症逐渐被认识,越来越多的研究者提出尽可能地保留SO的结构和功能并恢复胆道的正常生理结构,这一观点的提出使得一些研究者致力于弄清肝胆管结石患者SO松弛的发生原因。但迄今为止SO松弛的病因不明,学术界对肝胆管结石患者SO松弛的原因存在较大争议,一部分研究者认为排石过程对SO组织的机械性损伤是SO松弛的主要原因,另一部分研究者却发现SO松弛与否和可能存在的排石过程并无密切关系。炎性肠道病变和非结石性胆囊炎引起的平滑肌功能变化是近年来消化系统功能学研究的热点之一。炎症状态下平滑肌运动功能减弱与活性氧簇和亚硝酸盐等炎症代谢产物对平滑肌细胞膜的损害有密切关系,表现为钙离子稳态失衡,肌球蛋白轻链(myosin light chain, MLC)磷酸化障碍甚至纤丝状肌动蛋白(filamentous actin, F-actin)发生重塑。这些研究结果强烈的提示我们反复发作的胆道感染可能与肝胆管结石患者SO松弛有着密切的关系。但关于慢性胆道感染对SO功能有何影响目前尚未见相关报道。基于以上背景,我们推测:反复发作的胆道感染可能是SO平滑肌收缩功能减弱的重要原因。为验证我们的假说,本研究旨在通过临床研究,观察SO松弛患者的SO压力和肌电活动特征,分析肝胆管结石患者SO松弛的主要危险因素。随后通过建立兔胆道感染的动物模型,研究慢性胆道感染对兔在体和离体SO肌电活动的影响;最后从细胞水平阐明慢性胆道感染后SO平滑肌细胞收缩相关的钙离子动员、MLC磷酸化、F-actin重塑的发生情况。材料与方法一、采用环状电极记录肌电和三通道测压导管测压的方法,我们记录了肝胆管结石患者SO松弛时的SO压力和肌电特征,分析其SO基础压(SO basal pressure,SOBP)、峰压(SO amplitude,SOAP)和收缩持续时间(duration of SO contraction)、收缩频率(frequency of SO phasic contraction, SOF)以及SO肌电幅值(amplitude of SO spike burst, SOSB)的变化情况。进一步,采用多因素分析回顾性研究293例肝胆管结石患者SO松弛的发生情况,分析年龄、性别、病程、结石分布、结石大小、结石性状、既往手术次数、手术方式以及既往胆管炎发作次数等因素与SO松弛的相关性。二、用改良的Thomas法建立清醒状态下兔SO功能检测的动物模型,在清醒状态下记录兔SO的肌电活动,分析消化间期、静脉给予不同剂量的CCK和进食后SO肌电的变化情况。三、用胆总管内置丝线和经胆囊管连续3周(每周1次)向胆总管内注入大肠杆菌的方法建立慢性胆道感染的动物模型,以对照组和非感染组为对照,采用一般情况(饮食量、肛温、体重变化)、SO病理检测评分和肝功能检测的方法对模型进行判断。在模型终点进行在体和离体SO肌电记录,对慢性胆道感染组、对照组和非感染组的肌电活动进行比较。在体SO肌电记录分别比较在消化间期、静脉给予不同剂量的CCK后各组SO的肌电变化情况,分析慢性胆道感染对SO肌电活动的影响。离体实验采用完整切取SO组织、在离体器官浴槽中记录SO肌电活动的方法进行,比较各组SO在基础状态、CCK诱发的SO肌电频率、幅值变化情况,进一步,我们研究了在激动剂[60 mM KCl,50 nM ionomycin,10 nM cholecystokinin (CCK)]作用下和容量依赖的钙离子内流(capacitative calcium entry, CCE)诱导下胞外钙离子内流和胞浆内钙池钙离子释放引发SO肌电活动的变化。四、为研究慢性胆道感染对平滑肌细胞钙离子稳态、MLC磷酸化及F-actin表达的影响,我们对对照组,非感染组和慢性胆道感染组SO平滑肌细胞进行了原代分离和培养,首先用Fluo-3 AM负载后在激光共聚焦显微镜下观察激动剂(60 mM KCl,50 nM ionomycin,10 nM CCK)和CCE对胞浆内[Ca2+]i的影响,然后用Western-blot方法检测SO平滑肌组织中MLC磷酸化水平的改变,最后检测了FITC- phalloidin标记的平滑肌细胞骨架F-actin的表达情况。结果一、293例肝胆管结石患者中伴发SO松弛60例(20.5%),与SO不松驰的患者相比较,其SO基础压、峰压、收缩频率和收缩持续时间降低,SO肌电幅值和频率也相应降低。肝胆管结石的病程和多次发作的急性胆管炎与SO松弛的发生密切相关。二、建立了清醒状态下SO肌电检测的动物模型。禁食期间,SO的肌电活动呈周期性变化,肌电活动由较弱的1期经逐渐升高的2期过渡至肌电活动最强的第3期,4期为3期向1期的短暂过渡期。20 ng·kg-1和100 ng·kg-1的CCK以及进食可以明显兴奋SO的肌电活动。三、建立了慢性胆道感染的动物模型,慢性胆道感染后γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltransferase, GGT)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的明显升高,SO组织在病理上表现为黏膜层、肌层炎细胞浸润和肌层胶原纤维沉积增多,炎症评分明显增高。慢性胆道感染后SO肌电频率、运动指数在2期、3期明显减低,20 ng·kg-1和100 ng·kg-1的CCK兴奋SO肌电活动的作用减弱。同样,慢性胆道感染后静息状态及10 nM CCK诱导下离体SO肌电活动明显减低,促进胞外钙离子内流和胞内钙离子释放的激动剂诱发的肌电活动也明显减弱。四、利用胶原酶消化法,我们对兔SO平滑肌细胞进行了分离和培养。慢性胆道感染后,兔SO平滑肌细胞钙离子稳态失衡,包括KCl、CCE诱发的胞外钙离子内流和CCK、Caffeine诱发的胞内钙离子释放减少。此外,MLC磷酸化障碍、F-actin骨架重塑在慢性胆道感染后SO平滑肌细胞也有发生。结论一、肝胆管结石患者SO松弛的发生率较高,其运动特征为SO肌电活动减弱和压力降低,病程和多次发作的胆管炎是SO松弛的主要危险因素。二、慢性胆道感染后兔在体及离体SO肌电频率、幅值和运动指数均明显降低,其对CCK等激动剂的反应减弱。三、钙离子稳态失衡、MLC磷酸化障碍、F-actin表达下降可能是慢性胆道感染后SO平滑肌运动功能减弱的重要原因。