【摘 要】
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目的:SF-MA-BG通过HIF-1a通路促进糖尿病创面愈合。方法:1.通过溶胶-凝胶法制备铜掺杂硼硅酸盐生物玻璃,在此基础上通过硅烷偶联剂和甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）对生物活性玻璃进行改性,得到甲基丙烯酸基生物活性玻璃（BG-MA）。将BG-MA混合进光敏性丝素蛋白（BG-SF）中,使得在紫外光照下BG-MA和BG-SF可以发生共价交联。2.通过1H-NMR,XRD,ATR-FTIR,XPS
【基金项目】
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国家重点研究发展计划（编号:2018YFA0703100）； 国家自然科学基金（批准号:51802340、52072398、31870956、81672227,U2001221）； 中国科学院前沿科学重点研究计划（批准号:2001221）； QYZDB-SSW-JSC030；
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目的:SF-MA-BG通过HIF-1a通路促进糖尿病创面愈合。方法:1.通过溶胶-凝胶法制备铜掺杂硼硅酸盐生物玻璃,在此基础上通过硅烷偶联剂和甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）对生物活性玻璃进行改性,得到甲基丙烯酸基生物活性玻璃（BG-MA）。将BG-MA混合进光敏性丝素蛋白（BG-SF）中,使得在紫外光照下BG-MA和BG-SF可以发生共价交联。2.通过1H-NMR,XRD,ATR-FTIR,XPS对光敏性丝素蛋白和改性生物玻璃测试物理化学性质。3.通过CCK8细胞增值实验和live-dead染色实验确定材料对血管内皮细胞的增值影响。4.通过transwell和划痕实验观察材料在血管内皮细胞移动的影响。5.通过流式细胞仪检测敷料对raw在炎症状态下极化状态的改变。通过q PCR检测IL-1,Tnf-a,IL-6,i NOS,CD206,Vegf,TGF-β的基因表达,研究该材料在状态下对巨噬细胞极化状态的影响。6.通过q PCR检测VEGF,PDGF,HIF-a,ANG,e NOS,SDF-1的基因表达,通过Western Bolt检测Vegf和HIF-a的蛋白表达,研究该材料在体外对血管形成的影响。7.建立糖尿病大鼠模型,在大鼠背部制作两个1.5cm*1.5cm的创面。将敷料滴在创面后用紫外光照射30s可形成稳定创面覆盖。在手术后3,10,21d观察创面愈合情况,拍照并记录创面大小后取材。切片后分别采用HE和Masson’s三色染色。同时采用免疫荧光检测M1巨噬细胞（CD80）,M2巨噬细胞（CD206）,HIF-a,VEGF,i NOS,TGF-β,a SMA和CD31。结果:1.通过1H核磁共振（NMR）确认SF和SF-MA的结构,化学位移5.3ppm和5.6ppm处的峰表明存在甲基丙烯酰氧基。而GMA的甲基基团的特征共振峰（δ=1.8ppm）已通过添加GMA出现。此外,随着GMA的加入,赖氨酸亚甲基基团的特征峰（δ=2.9ppm）明显下降,表明SF中赖氨酸残基的修饰成功;通过ATR-傅里叶变换红外光谱在SF、SF-MA和SF-MA-BG中分别在1636、1516、1232和674 cm-1处发现了酰胺I、II、III和V的特征峰,1060 cm-1处的峰归因于SF的随机构型;在BG、BG-MA和SF-MA-BG中发现的1460和1050 cm-1的宽峰归因于硼硅酸盐玻璃的B-O-B和Si-O-Si振动。XRD结果表明所制备材料为非晶体结构。直径分布分析表明,BG颗粒的大小主要在1μm左右;而BG-MA是通过硅烷偶联剂对BG进行改性而成功得到的,根据XPS结果显示,存在C-C-C、C-C-O和C-C=O。2.用力学试验机测定SF-MA-BG的拉伸强度和粘结强度。添加BG-MA可进一步提高机械强度,最大抗拉强度可达40kpa,SF-MA-BG与猪皮的粘接强度也可达23kpa,为今后的临床应用提供了必要的强度保证。用ICP-OES说明了SF-MA-BG的降解行为和离子释放。SF-MA-BG水凝胶浸泡在PBS中,能稳定释放以Si、B、Cu离子为代表的各种治疗性离子,是SF-MA-BG水凝胶发挥生理功能的基础。3.通过CCk-8结果表明各组细胞都随着时间延长而增加,表明细胞保持良好活力,SF-MA-3BG组最高,SF-MA-6BG最低。Live-dead染色也显示相同的趋势。4.迁移和划痕实验结果表明SF-MA-3BG组可以更有效的促进内皮细胞迁移。5.q PCR结果表明,SF-MA-3BG组VEGF、HIF-α、PDGF、e NOS、Ang和SDF-1基因均表达上调,免疫荧光染色结果显示SF-MA-BG组HIF-α活性高于对照组和SF-MA组。Western免疫印迹结果也证实,用SF-MA-3BG提取液培养的细胞能表达更多的VEGF和HIF-α蛋白。6.流式和q PCR的结果表明该敷料可以促进炎症状态的RAW264.7向M2方向极化。SF-MA-BG可以提高VEGF,PDGF,HIF-a,ANG,e NOS,SDF-1的基因表达,以及HIF-a和VEGF的蛋白表达。7 HE染色结果和光学照片均显示SF-MA-BG组比SF-MA和control组有更快的愈合速度。Masson‘s三色染色表明SF-MA-BG组相对其他组具有更快的纤维修复速度。新生血管用a SMA和CD31共同标记,该结果表明SF-MA-BG组可以在3d和10d相比SF-MA和control组有更多的血管以及更大的血管直径。免疫荧光染色结果表明SF-MA-BG组相交于SF-MA和control组在3d和10d可以吸引更多的巨噬细胞。此外SF-MA-BG组中更多M2向的巨噬细胞。结论:BG-SF-MA敷料可以促进糖尿病溃疡的再生。其机制可能是SF-MA-BG重新激活了由于糖尿病抑制的HIF-a通路。同时对巨噬细胞的早期其吸引以及极化状态的改变为中期创面的恢复起了重要作用。
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