柠檬烯是植物天然单环单萜类次生代谢产物,常被广泛应用于食品、医药、化妆品、生物燃料、生物防治及化工生产等方面,具有极高的市场价值。目前,柠檬烯主要通过植物提取法进行工业生产,该方法不仅能耗大且难以保证柠檬烯的产量和质量。利用代谢工程策略和合成生物学技术构建微生物细胞工厂生产柠檬烯及其衍生物,具有绿色、产物纯度高、易于分离纯化、可规模化放大、供应稳定等优势。近年来代谢工程和合成生物学技术在微生物合成柠檬烯及其衍生物研究中取得了诸多进展,包括底盘微生物的选择和改造、关键酶的发掘与编辑、柠檬烯衍生物的微生物合成、发酵过程的优化、合成途径的设计、表达和优化等。目前将单萜及其衍生物生物合成途径整合进宿主细胞,仍然面临着单萜合酶具有多种活性、流向目标产物代谢通量低、天然稳态的干扰及单萜对宿主的细胞毒性等问题。圆红冬孢酵母具有较为广泛的底物利用谱和产物谱、较好的鲁棒性、发达的MVA途径等,可以作为高值化合物生物合成的底盘微生物。因此,本文以圆红冬孢酵母np11作为宿主菌,通过引入橙花基二磷酸合酶（NPPS）和柠檬来源的柠檬烯合酶（Clt LS1）构建了柠檬烯异源生物合成途径,探究了类胡萝卜素合成旁路途径及基因元件（启动子和柠檬烯合酶）对柠檬烯产量的影响;然后利用模块化工程、蛋白融合策略及组合代谢工程进一步改善柠檬烯合成;探究了圆红冬孢酵母过氧化物酶体区室化的能力,得到了N端和C端的过氧化化物酶体定位肽,并将正交柠檬烯合成途径靶向到过氧化物酶体;研究了圆红冬孢酵母异源生物合成柠檬烯衍生物的能力,为圆红冬孢酵母生产高值化合物提供一定的参考。本论文取得了结果如下:一、以圆红冬孢酵母为底盘构建了柠檬烯生物合成工程菌株。引入多毛番茄来源的NPPS和Clt LS1及过表达截短的内源羟甲基戊二酰-Co A还原酶（HMGR）,初步构建了正交柠檬烯异源生物合成菌株,产量达6.7 mg/L;当以类胡萝卜素缺陷菌株作为平台菌株,木糖还原酶启动子（p XYL）和柠檬烯合酶Clt LS1作为基因元件,柠檬烯的最高产量提高至37.71 mg/L。初步选择了柠檬烯生物合成的底盘细胞、基因元件等,为后面的研究打下基础。二、利用组合代谢工程改善了圆红冬孢酵母工程菌株柠檬烯的产量。通过引入MVA途径关键酶即来自粪肠球菌乙酰辅酶A（Ac-Co A）乙酰转移酶/HMG-Co A还原酶（Ef Mva E）和HMG-Co A合酶（Ef Mva S）和来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶（Mm MK）,工程菌株柠檬烯产量达107.23 mg/L;蛋白融合策略具有减少酶与底物的空间距离、提高底物的可及性、弱化代谢溢流及增强融合蛋白催化效率等作用,本研究利用蛋白融合策略将NPPS和Clt LS1进行融合,比较了5种蛋白柔性连接子及蛋白正/反向融合对工程菌株柠檬烯产量的影响,证明了利用GGGS将NPPS和Clt LS1正向融合能够改善柠檬烯的合成,得到139.74 mg/L的柠檬烯,是表达游离酶菌株的3.7倍;然后两种策略进行组合,得到的工程菌株产生393.48 mg/L的柠檬烯,进一步改善了工程菌株柠檬烯的产量;最后进行工程菌株柠檬烯耐受性实验,得到了较为耐受柠檬烯的菌株。三、圆红冬孢酵母过氧化物酶体区室化合成柠檬烯。以红色或绿色荧光蛋白作为荧光标记,以内源过氧化物酶体蛋白Pex11作为参考;利用荧光共定位的方法验证了过氧化物酶体I型定位肽（PTS1）及II型（PTS2）的定位效果,到了4个I型（AKL、SKL、AKM和ARL）及1个II型过氧化物酶体定位肽（PTS2-39AA）;对过氧化物酶体膜蛋白Pex11的结构进行分析,并截短/截取Pex11中的疑似II型定位肽的序列,与红色荧光蛋白融合表达,可能Pex11不含有I和II型过氧化物酶体定位肽,均不能将目标蛋白靶向到过氧化物酶体上。最后,利用PTS1（SKL）将柠檬烯合成途径的部分基因靶向到过氧化物酶体,获得菌株产生2.0 mg/L左右的柠檬烯。为圆红冬孢酵母过氧化物酶体区室化合成高值化合物提供了科学参考。四、分别引入香芹酮和薄荷酮异源生物合成途径,表征了圆红冬孢酵母合成萜类化合物的能力。通过引入大冷杉来源的香叶基焦磷酸合酶（GPPS）、薄荷来源的（-）-柠檬烯合酶（Mst LS）和香芹醇脱氢酶（CD）、拟南芥的细胞色素P450还原酶（CPR）与内源HMGR,实现香芹醇和香芹酮的初步合成;获得了表达（-）-柠檬烯合酶Mst LS、来自薄荷（Mentha x piperita）的细胞色素P450（-）-柠檬烯-3-羟化酶（L3H）和（-）-反式-异胡椒醇脱氢酶（IPDH）的工程菌株,但尚未检测到目标产物。结合前期实验结果分析可能是由于前体物供应不足导致的。综上,本研究实现了柠檬烯及其部分衍生物的从头生物合成,证明了圆红冬孢酵母区室化的潜能,是一株潜在的单萜类化合物高效合成的平台菌株。