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第一部分沉默p300、C/EBPp基因对Thy-1肾炎大鼠肾组织产生促Th17分化因子和增生病变的影响目的:研究沉默大鼠肾内p300、CCAAT增强子结合蛋白β(CCAAT enhancer bindingproteinβ,C/EBPβ)基因表达对Thy-1肾炎大鼠肾组织产生IL-6、TGF-β1(促Th17分化因子)和增生病变的影响。方法:利用三质粒系统包装能表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)的 p300、C/EBPβ基因和乱序阴性对照小发夹RNA干扰慢病毒表达载体,经肾动脉灌注导入大鼠肾组织。在确定能抑制肾组织中p300、C/EBPβ的表达后再用兔抗Thy-1抗原的抗体复制Thy-1肾炎模型,并在肾炎发病后6h和3d收取标本,通过Real-time PCR和蛋白印迹(Westernblot)检查Thy-1肾炎大鼠肾组织中IL-6,TGF-β1和IL-17的表达情况。此外,在肾炎发病后第7d检查肾炎大鼠肾组织的病理学改变。结果:成功包装出能够表达EGFP的p300和C/EBPβ小发夹RNA干扰慢病毒表达载体,并建立了大鼠肾动脉灌注上述慢病毒载体的手术方法。利用相应的慢病毒载体分别或共同沉默p300和C/EBPβ基因后发现,Thy-1肾炎大鼠的肾组织中IL-6、TGF-β1和IL-17的产生明显减少,另肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)的增生及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的分泌显著下降,且大鼠蛋白尿的水平也明显下调。结论:沉默大鼠肾内的p300和C/EBPβ的表达,能有效抑制Thy-1肾炎大鼠肾组织中IL-6、TGF-β1(包括IL-17)的产生及相应的增生病变。第二部分小鼠星形胶质细胞特异性基因启动子慢病毒载体的构建及组织表达和分布的鉴定目的:克隆小鼠星形胶质细胞特异性的基因启动子,以此构建特异性启动子慢病毒表达载体并检查其目的基因在细胞中的表达与分布。方法:利用PCR的方法,从小鼠基因组DNA中克隆小鼠星形胶质细胞特异性表达的蛋白——胶质细胞纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)基因启动子序列,并通过粘性末端的连接,构建入慢病毒三质粒系统中的携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)基因的转移质粒,替换原有的巨细胞病毒(CMV)启动子。体外感染四种细胞和体内感染脑组织后,用荧光显微镜与RT-PCR检查EGFP的组织表达和特异性分布情况。结果:成功克隆了GFAP基因启动子序列,并构建出含有GFAP基因启动子的慢病毒表达载体。荧光显微镜观察显示,EGFP蛋白主要在小鼠星形胶质细胞内表达。RT-PCR同时显示,EGFP的表达主要分布于脑组织中。结论:成功构建了含小鼠星形胶质细胞特异性表达蛋白GFAP启动子的慢病毒表达载体,实现了目的基因(EGFP)在星形胶质细胞中的高量表达。