木薯蛋白激酶MeMAPK1和MeMAPK8基因的分离与功能鉴定

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木薯(Manihot esculenta Crantz)为大戟科(Euphorbiaceae)木薯属植物,是世界三大薯类作物之一。由于木薯细菌性枯萎病(Xanthomonas axonopodis pv.manihotis,Xam)的侵染导致木薯产量损失达到1/3以上,给农业生产带来很严重的损失。MAPK(Mitogen-activated protein kinase)作为MAPK级联反应途径中的蛋白激酶,在植物抗病途径有至关重要的作用。到目前为止,在植物中发现了大量的MAPKs,例如拟南芥中的AtMAPK3和AtMAPK6对于植物的抗病性起关键作用,但是在木薯中关于MAPK信号通路的研究还很少。本研究根据模式生物拟南芥AtM4PK3(LOC_AT3G45640)和 AtMAPK6(LOC_AT2G43790.1)的氨基酸序列,经木薯数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)搜索,候选出木薯蛋白激酶MeMAPK1、MeMAPK8并通过生化功能预测、体外遗传互补实验和遗传转化等实验,对MeMAPK1、MeMAPK8在木薯PTI途径中的作用与调控机理进行研究。主要研究结果如下:(1)对木薯MAPKs家族进行分析,结合木薯与拟南芥、水稻等植物的亲缘关系,候选出两个与抗病有关的基因,命名为MeMAPK1和MeMAPK8。利用RT-PCR克隆MeMAPK1和MeMAPK8基因全长cDNA序列,MeMAPK1基因全长1215 bp,编码404个氨基酸;MeMAPK8基因全长1098bp,编码365个氨基酸。生物信息学分析表明MeMAPK1和MeMAPK8可能具有蛋白激酶的功能。(2)利用qRT-PCR方法分析在激素、生物胁迫和非生物胁迫下MeMAPK1和MeMAPK8的诱导表达情况,结果发现MeMAPK1在干旱、冷害胁迫下基因的表达量最高,MeMAPK8在激素、病原菌及非生物胁迫处理时会被诱导表达,基因的表达量均呈现先上升后下降的趋势,表明基因在激素和生物胁迫、非生物胁迫下均会做出响应,这些结果说明MeMAPK1和MeMAPK8不仅调控植物的抗病途径同时也对植物的生长发育也有很重要的调控作用。(3)构建MeMAPK1-GFP、MeMAPK8-GFP融合蛋白载体并转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析,结果表明MeMAPKl定位在细胞质中,MeMAPK8定位于细胞膜和细胞核内。(4)分别构建 pJG053-MeMAPK1-GFP 和 pJG053-MeMAPK8-GFP 超表达载体,并通过农杆菌介导花序侵染法将重组质粒导入到拟南芥。利用对转基因植株进行分子水平上的检测,结果表明插入拟南芥基因组中并能有效表达,获得5个转基因植株纯合株系。(5) Xam04和PstDC3000分别接种野生型、超表达及atmapk3和atmapk6突变体拟南芥植株进行抗病分析。结果表明接种Xam04后野生型和突变体植株叶片上有明显的病斑,而超表达转基因植株未见明显病斑,表明MeMAPK1和MeMAPK8转基因可以提高拟南芥对Xam04的抗病性。接种PstDC3000后atmpk6突变体植株表现为感病,而atmpk3突变体植株对PstDC3000表现为抗病,MeMAPK8过表达植株对于PstDC3000致病菌的抗性比MeMAPK1低。(6)利用酵母双杂交系统筛选MeMAPK1、MeMAPK8的互作蛋白。以MeMAPK1、MeMAPK8作为诱饵蛋白,在木薯cDNA文库中初步筛选到7个可能与诱饵蛋白存在互作关系的蛋白,后续将对靶蛋白与MeMAPK1和MeMAPK8互作蛋白的真实性进行验证。(7)构建MeMAPK1-GST、MeMAPK8-GST原核表达载体并转化大肠杆菌表达菌株 BL21(DE)。在IPTG 诱导后通过 Western blotting 证实 MeMAPK1、MeMAPK8 融合蛋白在大肠杆菌中能够表达。
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