论文部分内容阅读
目的产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrumβ-lactamases ESBLs）的革兰氏阴性杆菌感染多在医院内流行甚至爆发流行,但近来研究显示在社区获得性感染中分离率日益增高,目前关于社区居民中产ESBLs大肠埃希菌流行状况知之甚少,本研究旨在调查社区老年人肠道携带产ESBLs大肠埃希菌的流行情况、相关危险因素以及ESBLs的基因型,以确定产ESBLs大肠埃希菌在社区流行的程度及其特点。本研究还调查分析了本地区青霉素不敏感的肺炎链球菌（penicillinnonsusceptible streptococcus pneumoniae PNSP）临床分离株的青霉素结合蛋白（PBP）2b、2x及1a的基因变异特点,深入探讨其耐药机制;并采用多位点序列分型（MLST）对PNSP菌株进行基因分型以及确定与国际流行株的关系。上述研究将为控制和预防本地区青霉素不敏感肺炎链球菌的出现、传播及进化提供有益的线索。方法在铁西及东陵五个社区,共调查了286名社区老年人,填写调查问卷（包括姓名、性别、年龄;慢性疾病史如糖尿病等;过去3个月内是否应用抗生素;过去3个月内是否住院或外科手术）,获得知情同意后,采集肛拭子标本,立即接种于伊红美兰选择性培养基,培养分离鉴定大肠埃希菌,采用Kirby-Bauer药敏纸片法检测大肠埃希菌对18种抗生素的敏感性。采用纸片筛选法及双纸片协同法筛查产ESBLs的大肠埃希菌。采用脉冲电场凝胶电泳（PFGE）对产ESBLs大肠埃希菌进行同源性分析。应用SPSS13.0统计软件分析肠道携带产ESBLs大肠埃希菌的潜在危险因素。对产ESBLs大肠埃希菌采用PCR方法扩增ESBLs基因型及测序。另外收集2006年1月至2007年2月中国医科大学附属第一医院肺炎链球菌临床分离株19株,儿童医院肺炎链球菌临床分离株3株,省人民医院肺炎链球菌临床分离株2株,共24株,其中21株来自痰标本,1株分离自血标本,1株分离自脓汁,1株分离自眼分泌物。上述菌株通过奥普托欣纸片及胆汁溶菌实验进行鉴定。采用E-test法检测肺炎链球菌对青霉素及头孢噻肟的敏感性。选择18株肺炎链球菌（青霉素耐药株9株,青霉素中介耐药株5株及青霉素敏感株4株）进一步采用PCR方法扩增pbp2x、pbp2b、pbp1a基因及测序分析。另对9株肺炎链球菌进行MLST分析。结果1.产ESBLs的大肠埃希菌携带率为7.0%。270株大肠埃希菌对亚胺培南及美洛培南均100%敏感,非产ESBLs的菌株对头孢类抗生素敏感率在96%以上,对氟喹诺酮类药物敏感率在74%左右。按照临床实验室标准化研究所（CLSI）的规定,一旦确定为产ESBLs大肠埃希菌应视为对所有头孢类抗生素及氨曲南耐药。19株产ESBLs大肠埃希菌对阿米卡星敏感率94.7%,对阿莫西林/克拉维酸敏感率为63.2%。而且产ESBLs菌常表现出同时对氟喹诺酮类药物,复方新诺明,庆大霉素及四环素耐药。产ESBLs大肠埃希菌的单因素分析显示:3个月内抗生素暴露史与肠道携带产ESBLs大肠埃希菌密切相关（OR值3.2,95%可信区间1.1-9.0P=0.03）。19株产ESBLs大肠埃希菌进行同源性分析,其PFGE图谱呈多样性,提示具有不同起源。2.19株产ESBLs大肠埃希菌均为CTX-M型ESBLs,11株产CTX-M-14型（57.89%）:3株产CTX-M-22型;1株产CTX-M-24型;3株产CTX-M-79型;1株同时产CTX-M-24型及CTX-M-79型（编码CTX-M-79型基因的核苷酸序列G865→A碱基替换,导致氨基酸残基D289→N,故该基因序列出现变异,向GenBank提交该序列,获得序列号:EF426798）。另外TEM型阳性率为78.95%,均为TEM-1。19株产ESBLs大肠埃希菌中,8株（42.11%）整合子耐药基因盒扩增阳性,经测序分析,在整合子携带了两个耐药基因盒:dfr17（二氢叶酸原酶基因-耐甲氧苄啶）以及aadA5（氨基糖苷腺苷转移酶基因）。3.24株肺炎链球菌中,10株（41.67%）为青霉素敏感株（青霉素MIC=0.06mg/L）,5株（20.83%）为青霉素中介株（青霉素MIC＜0.06mg/L及＞2mg/L）,9株（37.5%）为青霉素耐药株（青霉素MIC-2mg/L）,青霉素MIC50为0.625mg/L,青霉素MIC90为4mg/L,MIC范围:0.016-4mg/L。而肺炎链球菌对头孢噻肟的敏感性:以1m/L及4mg/L为判断折点,15株（62.5%）为头孢噻肟敏感株（头孢噻肟MIC=1mg/L）,2株（8.33%）为头孢噻肟中介株（头孢噻肟MIC＜1mg/L及＞4mg/L）,7株（29.17%）为头孢噻肟耐药株（头孢噻肟MIC=4mg/L）,头孢噻肟MIC50为0.75mg/L,头孢噻肟MIC90为4mg/L,MIC范围:0.032-6mg/L。4.18株肺炎链球菌扩增pbp2x、pbp2b、pbp1a基因并测序后,经BioEdit分析及ClustalW比对:首次发现在菌株sp23的PBP2x氨基酸序列中,紧邻第一个保守基序STMK出现了Met342→Ile位点的氨基酸替换,伴有青霉素MIC=4mg/L及头孢噻肟MIC=6mg/L。序列分析提示:大多数PRSP菌株（青霉素MIC=1.5mg/L及头孢噻肟MIC=2mg/L）具有相同的PBP2b,2x及1a氨基酸序列,而PISP菌株的氨基酸替换则不同于其它国家,表现出本地区独特的基因重排。在本研究中出现了基因序列新的变异,已向GenBank提交,获得序列号:EU035969-EU035971,EU044831,EU056919-EU056922,EU089705-EU089709,EU106881-EU106887,EU124672。5.对9株肺炎链球菌进行MLST分析:4株PRSP菌株（sp02、sp09、sp23及sp24）具有相同的等位基因图谱（ST320）,为Taiwan19F-14克隆株（ST236 15-16-19-15-6-20-26）的aroE及ddl位点的双位点变异体（DLV）;菌株sp18（PRSP）是Spain23F-1克隆株（ST81 4-4-2-4-4-1-1）的recP位点的单位点变异体（SLV）;PISP菌株（sp01）是Taiwan19F-15克隆株（ST242 15-29-4-21-30-1-14）的recP位点的SLV;sp14与流行株Taiwan19F-14存在spi,xpt及ddl三个位点的差异体（triple-locusvariants TLVs）;在已知MLST数据库中未查到sp15的序列号,提示其为新型。另外sp11为未分型的肺炎链球菌株。结论本项研究提示:在本地区社区老年人中,肠道是产ESBLs菌的重要储菌库,先前的抗生素暴露史与产ESBLs大肠埃希菌肠道携带密切相关。我们的研究将为大肠埃希菌所致的内源性感染如泌尿系统感染及腹腔内感染的抗生素治疗策略提供一定的借鉴作用,并且提醒我们有必要制定相关的政策,采取有效措施,促进抗菌药物合理应用,尽可能减少产ESBLs大肠埃希菌的定植。本研究还发现本地区的PRSP的pbp2b,pbp2x,pbp1a基因序列高度一致,出现了克隆传播,主要为Taiwan19F-14克隆株,提示这一耐药流行株的克隆传播可能是本地区青霉素耐药性迅速增加的主要原因之一;而PISP菌株则表现出不同的基因重排,分属于不同的克隆株。我们的研究将为监测本地区β-内酰胺类药物耐药的肺炎链球菌的基因改变奠定基础。