云南重楼内生菌的分离鉴定及其对重楼皂甙的生物转化研究

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重楼皂甙(Polyphyllin)是云南重楼(Paris polyphylla Smith var.yunnanensis)的主要活性成分,具有多种药理作用。目前,利用植物内生菌对宿主植物内的成分进行生物转化的报道还很少。本研究从云南重楼中分离纯化内生菌,并对其进行分子生物学鉴定。用重楼内生菌,对重楼中重楼皂甙的主要成分重楼皂甙I (Polyphyllin I)、重楼皂甙II(Polyphyllin II)、重楼皂甙VII (Polyphyllin VII)进行生物转化筛选,扩大培养规模,对转化产物进行分离纯化和结构鉴定。取得以下结果:(1)从云南文山采集的人工栽培重楼根茎和野生的重楼根茎,分别分离纯化得到40和44株云南重楼内生细菌。经16S rDNA鉴定所得到的内生细菌分别属于6和8个属。其中,人工栽培云南重楼内生细菌中,芽孢杆菌属(Bacillus)和肠杆菌属(Enterobacter)分别占总数的35%、27.5%,是其优势内生细菌群;野生云南重楼内生细菌中,芽孢杆菌属(Bacillus)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)分别占总数的36.4%、20.4%,是其优势内生细菌群。该部分结果体现了人工栽培和野生云南重楼根茎中内生细菌的多样性,为后续云南重楼内生细菌的多样性开发,提供了理论和实验基础。(2)通过单因素实验考查溶剂种类、溶剂浓度和料液比对重楼总皂甙得率的影响,确定了重楼总皂甙最佳提取条件:料液比为1:8、乙醇浓度为70%、浸提3次。利用硅胶柱、凝胶柱,将从市场购买的重楼饮片中分离纯化得PA22、PB2、PD2三种重楼皂甙单体。经核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance,简称NMR)、液相质谱(liquidchromatography tandem mass spectrometry,简称LC-MS)等手段确定PA22和PB2与报道过的Polyphyllin I结构一致;PD2与报道过的Polyphyllin VII结构一致。(3)以上述所得内生菌和分离条件为基础,利用前期分离纯化的84株云南重楼内生细菌对Polyphyllin I、Polyphyllin II、Polyphyllin VII进行生物转化实验,筛选出YA09菌株对Polyphyllin VII具有转化作用,并得到ZH-1、ZH-2两种转化产物。产物经NMR、LC-MS检测分析,确定ZH-1与报道过的Polyphyllin VI结构一致;ZH-2很可能为pennogenin-3-O--L-rhamnopyranosyl(1→4)-[-L-rhamnopyranosyl(1→2)]-β-D-glucopyranoside。目前还未发现此化合物结构报道,可能为一种新化合物。本研究表明利用植物内生菌开发新资源具有极大的可能性,为开发新型中药单体药物提供了一种可能途径。
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