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背景和目的:白血病是一种起源于造血干祖细胞的恶性血液系统疾病,白血病细胞的不可控增殖是其典型病理特征。白血病细胞大量增殖一方面通过干扰正常的造血可引起多系正常血细胞减少,另一方面还可以浸润到多种组织以及器官进而影响其生理功能。急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是成人最常见的急性白血病之一,其发病迅速,如果不及时治疗可在数周内死亡。目前认为,AML的病理原因主要为造血细胞分化和成熟受阻、过度增殖以及异常分化,是一种异质性较高的血液恶性肿瘤。目前,AML的治疗以传统的大剂量联合化疗为基础,对于中高危分组可行造血干细胞移植,但白血病复发仍是该类疾病的最主要死亡原因。白血病的发生受到遗传、环境、基因等多种因素的影响,研究白血病的发生机制对于其治疗具有重要意义。虽然白血病发生的诱因或病因多种多样,但这些因素都需通过改变正常造血细胞的生物学状态进而使其获得不可控增殖能力而最终恶变。因此研究白血病细胞恶变过程中发生或参与的关键分子生物学事件是揭开白血病成因,并以此寻找精准治疗靶点的关键。circRNA在20世纪70年代研究RNA病毒时被发现,后续在真核生物内也发现了circRNA的普遍性存在。circRNA多数由外显子组成,其侧链是含有反向的ALU序列的内含子,circRNA与线状RNA不同,其不容易被核酸外切酶降解,因此circRNA在细胞中稳定性较高,参与蛋白质结合、miRNA结合、蛋白质翻译等过程。近年来研究发现circRNA可以通过调控肿瘤相关miRNA,进而影响肿瘤进展和转移。circPAN3是目前发现的与肿瘤有关的一种circRNA。在白血病中的研究表明,其可能参与了AML疾病进展,并介导耐药发生。为进一步明确circPAN3调控AML细胞增殖和凋亡的生物学过程,我们设计并实施了本研究课题,以期为AML的精准治疗提供更多的认识和分子靶点。本次课题包括以下三个部分:第一部分:circPAN3对于急性髓系白血病的临床意义;第二部分:circPAN3对miR-370-3p/TSPAN3调控机制研究;第三部分:circPAN3通过miR-370-3p/TSPAN3/Wnt/β-Catenin轴调节AML的功能验证。第一部分circPAN3对于急性髓系白血病的临床意义方法:1.利用qRT-PCR检测40例AML患者中circPAN3表达变化。2.利用qRT-PCR检测AML细胞和正常骨髓基质细胞中circPAN3表达变化。3.放线菌素D和RNase R检测circPAN3稳定性。结果:1.circPAN3在AML患者中相对高表达,高表达circPAN3的患者生存率较低,circPAN3表达水平与患者的年龄、性别,初诊时白细胞和血小板计数无关,与患者的FAB分型、细胞遗传学等有关。2.正常骨髓基质细胞中的circPAN3表达水平明显低于AML细胞。3.circPAN3在AML细胞中是一个稳定的环状RNA。第二部分circPAN3对miR-370-3p/TSPAN3调控机制研究方法:1.生物信息学软件预测circPAN3与miR-370-3p、miR-370-3p与TSPAN3靶向关系,荧光素酶实验和RIP实验鉴定靶向关系。2.qRT-PCR和Western blot分别检测AML患者、AML细胞和正常骨髓基质细胞中miR-370-3p和TSPAN3 m RNA以及TSPAN3蛋白表达水平。3.在AML细胞中转染circPAN3过表达载体、circPAN3 si RNA、miR-370-3p mimic、miR-370-3p inhibitor,共转染circPAN3 si RNA和miR-370-3p inhibitor、circPAN3过表达载体和miR-370-3p mimic;用qRT-PCR法检测circPAN3、miR-370-3p和TSPAN3 m RNA表达水平;Western blot法检测TSPAN3蛋白表达水平。4.采用Pearson分析circPAN3、miR-370-3p、TSPAN3表达水平之间的相关性。结果:1.circPAN3与miR-370-3p为靶向关系,miR-370-3p与TSPAN3为靶向关系。2.AML患者和AML细胞中miR-370-3p表达水平降低,TSPAN3 m RNA和蛋白表达水平升高。3.转染circPAN3过表达载体或miR-370-3p inhibitor的AML细胞中miR-370-3p表达水平降低,TSPAN3 m RNA和蛋白表达水平升高;转染circPAN3si RNA或miR-370-3p mimic的AML细胞中miR-370-3p表达水平升高,TSPAN3m RNA和蛋白表达水平降低;共转染circPAN3 si RNA和miR-370-3p inhibitor的AML细胞TSPAN3 m RNA和蛋白表达水平升高;共转染circPAN3过表达载体和miR-370-3p mimic的AML细胞TSPAN3 m RNA和蛋白表达水平降低。4.AML患者中miR-370-3p和circPAN3表达水平负相关;miR-370-3p和TSPAN3 m RNA表达水平负相关;circPAN3与TSPAN3 m RNA的表达水平呈正相关。第三部分circPAN3通过miR-370-3p/TSPAN3/Wnt/β-Catenin轴调节AML的功能验证方法:1.在AML细胞中转染circPAN3 si RNA,CCK-8法检测细胞增殖,PI单染法检测细胞周期分布,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡变化,Western blot检测细胞中cyclin D1、p21、Bax、Bcl-2、Cas-3 Cleavage蛋白表达变化。2.在AML细胞中共转染circPAN3 si RNA、miR-370-3p inhibitor和circPAN3si RNA、miR-NC inhibitor,CCK-8法检测细胞增殖,PI单染法检测细胞周期分布,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡变化,Western blot检测细胞中cyclin D1、p21、Bax、Bcl-2、Cas-3 Cleavage蛋白表达变化。3.在AML细胞中转染miR-370-3p mimic,共转染miR-370-3p mimic、pc DNA-TSPAN3,共转染miR-370-3p mimic、pc DNA-NC,CCK-8法检测细胞增殖,PI单染法检测细胞周期分布,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡变化,Western blot检测细胞中cyclin D1、p21、Bax、Bcl-2、Cas-3 Cleavage蛋白表达变化。4.在AML细胞中转染circPAN3 si RNA、circPAN3过表达载体,共转染circPAN3 si RNA、pc DNA-TSPAN3,共转染circPAN3 si RNA、pc DNA-NC,共转染circPAN3过表达载体、si RNA control,共转染circPAN3过表达载体、TSPAN3si RNA,Western blot检测Wnt1、β-Catenin蛋白表达。5.在AML细胞中转染circPAN3过表达载体,给予Wnt/β-Catenin信号通路抑制剂C59处理,CCK-8法检测细胞增殖,PI单染法检测细胞周期分布,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡变化,Western blot检测细胞中cyclin D1、p21、Bax、Bcl-2、Cas-3 Cleavage蛋白表达变化。结果:1.转染circPAN3 si RNA或miR-370-3p mimic后AML细胞增殖能力降低,细胞G0/G1期比例升高,细胞凋亡增多,Bcl-2、cyclin D1蛋白表达水平降低,Bax、Cas-3 Cleavage、p21蛋白表达水平升高。2.与共转染circPAN3 si RNA和miR-NC inhibitor相比,共转染circPAN3si RNA和miR-370-3p inhibitor后AML细胞增殖能力升高,处于G0/G1期的细胞比例下降,细胞凋亡减少,细胞中Bcl-2、cyclin D1蛋白表达水平升高,Bax、Cas-3 Cleavage、p21蛋白表达水平降低;与共转染miR-370-3p mimic和pc DNA相比,共转染miR-370-3p mimic和pc DNA-TSPAN3后AML细胞增殖能力升高,细胞G0/G1期比例降低,细胞凋亡减少,细胞中Bcl-2、cyclin D1蛋白表达水平升高,Bax、Cas-3 Cleavage、p21蛋白表达水平降低。3.转染circPAN3 si RNA后AML细胞中Wnt1、β-Catenin蛋白表达水平降低;共转染circPAN3 si RNA、pc DNA-TSPAN3后AML细胞中Wnt1、β-Catenin蛋白表达水平升高;共转染circPAN3过表达载体、TSPAN3 si RNA后的AML细胞中Wnt1、β-Catenin蛋白表达水平升高。4.Wnt/β-Catenin信号通路抑制剂C59能够逆转circPAN3过表达载体对AML细胞增殖促进、周期促进和凋亡抑制作用。结论:1.circPAN3在AML中相对高表达。circPAN3高表达与AML患者的生存率较低、FAB分型及细胞遗传学有关。2.下调circPAN3能够抑制AML细胞增殖,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡。3.circPAN3可作为miR-370-3p海绵,进而调控miR-370-3p靶基因TSPAN3的表达。4.circPAN3通过miR-370-3p/TSPAN3/Wnt/β-Catenin轴调节AML细胞的生物学功能。